医学检验信息网 检验医学 2007-2-26 16:16:48

连接产物的转化及重组子的筛选和鉴定：取1μl连接产物转化受体菌E.coli JM 109的感受态细胞。挑取具有氨苄青霉素(Amp)抗性的菌落于3ml含100μg/ml Amp的LB培养液中37℃振摇过夜培养。碱裂解法小量快速提取质粒DNA进行双酶切鉴定。

DNA序列分析：碱裂解法大量抽提经双酶切鉴定的重组克隆质粒，用自动测序仪进行序列分析。

结果

1.HspA的扩增：PCR结果电泳分析发现在342bp左右有1条带，位于PCR markers的第5条带下方处，大小与预计相符(见图1)。

2.重组质粒的构建及酶切鉴定：重组质粒的构建如图2，将PCR产物经EcoRⅤ/HindⅢ双酶切后，定向插入经同样双酶切的PinPoint^TmXa-3载体中，获得的重组质粒命名为PinPoint^TmXa-3/HspA。经EcoRⅤ/HindⅢ双酶切后的重组质粒电泳，结果见图3。双酶切后产生的片段为大小约定的342bp的片段。

图1 琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物

Fig 1. Identification of the PCR product by DNA agarose gel electrophoresis

1. PCR marker; 2. PCR product

图2 重组质粒PinPoint^TmXa-3/HspA的构建示意图

Fig 2. The scheme for construction of the recombinant plasmid PinPoint^TmXa-3/HspA

3.HspA基因片段的序列分析：把人Hp菌中扩增得到的HspA基因片段克隆至PinPoint^TmXa-3中大量抽提重组质粒PinPoint^TmXa-3/HspA，全自动测序仪进行序列分析，结果表明基因序列与文献报道的一致。20～361bp为所扩增片段的互补链基因序列。HspA

图3 重组质粒PinPoint^TmXa-3/HspA的双酶切鉴定图谱

Fig 3. Double restriction enzyme digestion map of recombinant plasmid PinPoint^TmXa-3/HspA

1. PCR product; 2, 3, 6, 7, 8. Positive recombinant plasmid PinPoint^TMXa-3/Hsp respectively; 4, 5. Negative recombinant plasmid respectively

基因编码区的核苷酸序列和氨基酸序列如下：

ATG AAG TTT CAA CCA TTA GGA GAA AGG GTC TTA GTA GAA

M K F Q P L G E R V L V E

AGA CTT GAA GAA GAG AAC AAA ACC AGT TCA GGC ATC ATC

R L E E E N K T S S G I I

ATC CCT GAT AAC GCT AAA GAA AAG CCT TTA ATG GGC GTA

I P D N A K E K P L M G V

GTC AAA GCG GTT AGC CAT AAA ATC AGC GAG GGT TGC AAA

V K A V S H K I S E G C K

TGC GTT AAA GAA GGC GAT GTG ATC GCT TTT GGA AAA TAC

C V K E G D V I A F G K Y

AAA GGT GCA GAA ATC GTT TTA GAC GGC GTT GAA TAC ATG

K G A E I V K D G V E Y M

GTG CTA GAG CTA GAA GAC ATT CTA GGT ATT GTG AGC TCA

V L E L E D I K G I V S S

GGC TCT TGT TGT CAG ACA GAT AGT CAT GAC CAT AAA CAT

G S C C Q T D S H D H K H

GCT AAA GAG CAT GAA GCT CGC TGT CAT GAA TAA

A K E H E A R C H E *

讨论

热休克蛋白(Hsp)是一种高度保守的蛋白质，可被多种环境应激变化如高温、炎症、放射病毒感染、恶性肿瘤转移、活性氧代谢产物、重金属、乙醇及缺氧等诱生^〔5〕。由于热休克蛋白呈现一个巨大的分子结构，其分子质量与尿素酶的天然分子质量相近。且其结构类似于尿素酶，故早期的研究中曾认为热休克蛋白是尿素酶的一个亚单位^〔6〕。Hp的Hsp基因属于双顺反子操纵子包括HspA和HspB基因，分别编码118和545个氨基酸残基，相应的相对分子质量为13.0×10³和58.2×10³。HspA包括两个区域：N区(A区)与GroES家族同源高度保守，是免疫显性区^〔7〕，C区(B区)有27个氨基酸残基，其中8个是组氨酸残基，4个是半胱氨酸残基，提示这是一个金属结合区域，和尿素酶复合体有关^〔8〕。HspA可能在镍离子转运和呈递给脱辅基酶蛋白中起作用^〔9〕。HspA与尿素酶B亚单位(UreB)一样是有效的抗原成分，可以作为基因工程疫苗的侯选分子。

本研究根据国外报道的人Hp基因序列，设计并合成了特异性引物P1和P2，在两者5′端分别加有起始密码子ATG和终止密码TAA及HindⅢ和EcoRⅤ限制性酶切位点，并且为了保持两引物的Tm值相似，将序列的末尾几个碱基删除，同时为使扩增基因的AAGCTT片段不被HindⅢ酶解，把后一个“T”突变为“G”。由于上述在引物设计方面的优化，使PCR反应更特异，更灵敏，并使目的基因的鉴别变得较简便，也为下一步的研究工作打下基础。

采用PCR技术获得了特异的Hp的HspA DNA并进行序列分析得到证实。为制备特异性核酸探针，重组表达HspA及基因工程疫苗的进一步研究奠定了重要实验基础。

基金项目：国家“九五”重点攻关课题(NO 96-901-01-54)；全军“九五”医药卫生科研基金资助项目

参考文献

1 International agency for research on cancer. WHO Press Release. 1994, No. 106.

2 EHPSG. Abstract of Ⅷth internation workshop on gastric duodenal pathology and Helicobacter pylori. Gut, 1995, 7-9th July.

3 Marta M. Development of a mouse model of Helicobacter pylori. Infection that mimics human disease. Science, 1995, 267, 17.

4 Sebastian S, Thiberge JM, Kansau I, et al. Helicobacter pylori HspA-HspB heat-shock gene cluster: nucleotide sequence, expression, putative function and immunogenicity. Mol-Microbiol, 1994, 14(5):959-974.

5 范学工，夏华向主编. 幽门螺杆菌感染——基础与临床. 长沙: 湖南科学技术出版社, 1997, 12.

6 Dunn BE, Roop RM, Sung CC, et al. Identification and purification of a cpn60 heat shock protein homologue from Helicobacter pylori. Infect Immun, 1992, 60:1946-1951.

7 Kansau I, Guillain F, Thiberge JM, et al. Nickel binding and immunological properties of the C-terminal domain of the Helicobacter pylori GroES homologue (HspA). Mol-Microbio, 1996, 22(5):1013-1023.

8 Wu LF. Putative nickel-binding sites of microbial proteins. Res Microbiol, 1992, 143:347-351.

9 Tomb JF, White O, Kerlavage AR, et al. The complete genome sequence of the gastric pathogen Helicobacter pylori. Nature, 1997, 388:539-547.

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