伤寒沙门菌DNA旋转酶gyrA及拓扑异构酶Ⅳ parC基因与耐喹诺酮类关系研究
药敏试验：以试管双倍稀释法测定抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)。过夜生长的细菌，以生理盐水稀释为0.5麦氏单位，加入到倍比稀释抗生素的系列MHB中，使最终接种量为(104～105CFU)/ml，37℃孵育18h后观察结果，以确定抑制细菌生长的最低药物浓度(MIC)。
多聚酶链反应扩增gyrA与parC：参考文献方法〔3〕。1ml过夜培养的伤寒沙门菌10000×g，5min收集沉淀，加入600μl TE缓冲液(pH8.0)混悬，加入10％SDS 30μl，37℃孵育1h后，用等量酚、酚氯仿、氯仿抽提后作模板DNA。50μl反应混合物含10mmol/L Tris-HCl(pH9.0)、50mmol/L KCl、0.1％ Triton X-100、1.5mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTP、1U Taq酶、上下游引物各50pmol、DNA模板2μl。初始循环94℃，1.5min；60℃，2min；72℃，3min。后续94℃，1min；60℃，1min；72℃，3min；30循环。最后72℃延伸15min。产物以2％琼脂糖电泳，0.5μg/ml溴化乙锭染色，紫外光下观察结果。核酸相对分子质量标准为pBR322/HinfⅠ片段。
PCR产物测序：利用PCR产物纯化试剂盒，按产品说明纯化gyrA、parC PCR产物，纯化产物以前述引物为引物，用末端标记测序试剂盒，在Perkin-Elmer ABI 310型自动测序仪测序。
结果1.药敏试验：NA、OFLX、CPFX对S275的MIC值分别为2、0.06、＜0.03mg/L，对RG1则为512、2、1mg/L，较对伤寒沙门菌275明显上升32倍以上。
2.gyrA测序结果及推定氨基酸序列(图1、2)：S275 gyrA QRDR与大肠埃希菌KL-16高度同源，两者仅23个碱基差异，占所测序列碱基的7.49％，且大部分为保守替换，推定氨基酸序列仅有3个差异，第45、49与56位氨基酸分别为Thr→His，Arg→Leu及Val→Gly变异〔4〕。RG1碱基仅于274位T→G变异，致相应第83位氨基酸由Ser→Ala变异，该位变异导致疏水性发生改变而与药物亲和力降低，细菌敏感性降低。
图1 伤寒沙门菌与大肠埃希菌gyrA耐喹诺酮类决定区核苷酸序列（*示与S275相同）
Fig 1. The uncleotide sequence of gyrA QRDR in S.typhi and E.coli
*：indicated the same as that of S275
图2 伤寒沙门菌与大肠埃希菌gyrA推定氨基酸序列（*示与S275相同）
Fig 2. The deduced amino acid sequence of gyrA QRDR in S.typhi and E.coli
* indicated the same as that of S275
3.parC测序结果及推定氨基酸序列(图3、4)：S275 parC基因所测部分序列与大肠埃希菌高度同源，两者仅有10个碱基差异，占所测序列的2.99％，致推定氨基酸序列6处差异〔5〕。RG1与S275完全相同。
图3 伤寒沙门菌与大肠埃希菌parC耐喹诺酮类决定区核苷酸序列（"示与伤寒沙门菌相同）
Fig 3. The nucleotide sequence of parC QRDR in S.typhi and E.coli
′′ indicated the same as that of S.typhi
图4 伤寒沙门菌与大肠埃希菌parC耐喹诺酮类决定区推定氨基酸序列（*示与伤寒沙门菌相同）
Fig 4. The deduced amino acid sequence of parC QRDR in S.typhi and E.coli
* indicated the same as that of S.typhi
伤寒沙门菌parC序列与gyrA比较，两者所测部分同源性高，推定氨基酸有60.92%(53/87)相同，尤以位于parC 80位Ser及118位Tyr周围两者完全相同。此与大肠埃希菌gyrA及parC关系相似〔5〕。
讨论细菌DNA拓扑异构酶有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4种，分两大类，第一类有拓扑异构酶Ⅰ和Ⅲ，主要参与DNA链松解，第二类包括拓扑异构酶Ⅱ和Ⅳ，其中拓扑异构酶Ⅱ又称DNA旋转酶，参与DNA超螺旋的形成，拓扑异构酶Ⅳ则参与细菌复制的子代染色质分配到子代细菌〔5〕。
DNA旋转酶作为喹诺酮类药物作用靶位，已得到肯定。该酶由A、B两亚单位构成，分别由gyrA、gryB基因编码。A亚单位使双链DNA切断并与断端碱基暂时结合，促使另一条双链通过切口而改变DNA双链的螺旋状态。喹诺酮类药物通过嵌入断裂DNA链，形成酶-DNA-药物三者复合物，抑制酶活性，达到杀菌目的。当DNA 旋转酶发生变异时，三者复合物形成受阻，细菌对药物则产生耐性，其中尤以A亚单位第67～106位氨基酸变异更为突出，因此该区域被称为耐喹诺酮类决定区(QRDR)，本研究发现S275与大肠埃希菌gyrA相应片段碱基序列同源性达92.51％，氨基酸序列差异很小，表明两者受喹诺酮类作用机理应相同。RG1与S275比较，仅第247位碱基T→G变异，相应第83位氨基酸Ser→Ala替换，使该位点亲水性降低，药物与酶亲和力降低，致喹诺酮类药物对RG1 MIC值上升达32倍以上。与文献报道其它细菌第 83位Ser为耐药主要变异点一致〔4-6〕。
DNA拓扑异构酶Ⅳ由parC及parE两亚单位组成，大肠埃希菌基因及氨基酸序列分析发现parC与DNA旋转酶gyrA同源性达35.9％，其中尤以parC及gyrA N 末端同源性更高，该区域为酶活性中心，包含gyrA QRDR。对大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌研究发现，喹诺酮类药物对拓扑异构酶Ⅳ活性有抑制作用，且在金黄色葡萄球菌，拓扑异构酶Ⅳ较DNA旋转酶对药物更敏感， 细菌对喹诺酮类耐药常先有拓扑异构酶Ⅳ变异，表明拓扑异构酶Ⅳ也为喹诺酮类作用靶位，且为革兰氏阳性菌的第一靶位〔1,2〕。本研究发现，S275 parC及gyrA相应区段有较好同源性，氨基酸序列有60.92％相同，尤以酶活性位点118 Tyr及喹诺酮类作用主要位点80 Ser周围，两者完全相同， RG1与S275 parC无差异。表明伤寒沙门菌与大肠埃希菌相似，parC也可能为喹诺酮类作用靶位，但非第一靶位〔1〕。
参考文献
1 Hoshino K, Kitamura A, Morrissey I, et al. Comparison of inhibition of Escharichia coli topoisomerase Ⅳ by quinolones with DNA gyrase inhibition. Antimicrob Agent Chemother, 1994, 38:2623-2627.
2 Ferrero L, Cameron B, Crouzet J, et al. Analysis of gyrA and grlA mutations in step-wise selected ciprofloxacin-resistant mutants of Staphylococcus aureus. Antimicrob Agent Chemother, 1995, 39:1554-1558.
3 Sambrook J, Fritsch EF, Maniativ F. Molecular Cloning, a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989.
4 Yoshida H, Kojima T, Yamagishi T, et al. Quinolone resistant mutations of the gyrA gene of Escherichia coli. Mol Gen Genet, 1988, 211:1-7.
5 Kato J, Nishimura Y, Imamura R, et al. New topoisomerase essential for chromosome segregation in E. coli. Cell, 1990, 63:393-404.
6 Griggs DJ, Gensberg K, Piddock LJV. Mutations in gyrA gene of quinolone resistant Salmonella serotypes isolated from humans and animals. Antimicrob Agent Chemother, 1996, 40:1009-1013.
