双歧杆菌脂磷壁酸对HL-60细胞端粒酶活性的影响

【 摘要 】 目的 探讨双歧杆菌表面分子脂磷壁酸（LTA）对体外培养的HL-60白血病细胞端粒酶活性的影响。 方法 采用PCR-ELISA法检测经LTA处理前后的HL-60白血病细胞株端粒酶活性的改变。 结果 经LTA处理后，HL-60白血病细胞的生长受到抑制，端粒酶活性明显降低。 结论 双歧杆菌LTA对HL-60白血病细胞具有生长抑制作用，其抗肿瘤作用的机理可能与抑制肿瘤细胞的端粒酶活性有关。 Effects to telomerase activity by lipoteichoic acids of Bifidobacterium in HL-60 cells

WANG Yue, DENG Yiping, HU Hong

（Department of Clinical Microbiology, Chongqing University of Medical Science, Chongqing 400016, P.R.China）

【 Abstract 】 Objective To investigate effects to telomerase activity by lipoteichoic acids (LTA) of Bifidobacterium in HL-60 cells in culture. Methods MTT assay was used to investigate the inhibitory effect of LTA on HL-60 cell in culture. The telomerase activity in cells treated by LTA was detected by PCR-ELISA assay which is based upon PCR amplification of the initial telomerase product and detected by ELISA. Results The growth of HL-60 cells was inhibited by 20μg/ml LTA and the inhibitory effect was time-and dose-dependent. After being treated with 40μg/ml LTA for 3 days, the telomerase activity in HL-60 cells was significantly reduced to about 34.2% of that in untreated control. Conclusion The lipoteichoic acids of Bifidobacterium could directly inhibit the growth of HL-60 cells. The mechanism of anti-tumor by lipoteichoic acid may be explained by the inhibition of telomerase activity in cells by LTA.

【 Subject words 】 Bifidobacterium; HL-60 cells; Telomerase

端粒(telomere)是真核生物染色体末端的一种保护性结构，在维持染色体的稳定性和一致性等方面具有重要作用。正常人体细胞由于周期性复制而使端粒的长度逐渐缩短。端粒酶（Telomerase）是一种特殊的核糖核蛋白聚合酶, 它能够利用自身携带的RNA作为模板逆转录合成端粒，从而维持端粒的长度，使细胞获得无限增殖的能力，成为永生化细胞。大多数肿瘤细胞都表现出较高的端粒酶活性。正常体细胞由于缺乏端粒酶活性，其端粒随着细胞分裂逐渐缩短，细胞逐渐老化、死亡。大量研究表明，端粒酶活性与肿瘤的发生有密切关系，抑制端粒酶活性可以抑制肿瘤细胞的生长。因此，寻找端粒酶抑制剂正逐渐受到人们的关注^〔1-4〕。 双歧杆菌是人体肠道内的正常菌群，其抗肿瘤作用已经得到肯定^〔5,6〕，对其抗肿瘤机制也进行了广泛研究，主要认为双歧杆菌通过增强机体的免疫功能而间接发挥抗肿瘤作用，对其表面分子在抗肿瘤中的直接作用研究尚少。本实验通过测定双歧杆菌LTA处理后HL-60白血病细胞端粒酶活性的变化，探讨双歧杆菌LTA对肿瘤细胞端粒酶的影响，为进一步研究双歧杆菌的抗肿瘤机制提供依据。

双歧杆菌脂磷壁酸（lipoteichoic acids，LTA）的制备：分叉双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum, B.bifidum）由本室分离保存，经中国科学院微生物研究所鉴定。LTA由本室按Sutcliffe等^〔7〕的方法从B.bifidum中提取，-20℃保存。

细胞株：人早幼粒白血病细胞株HL-60由军事医学科学院药理研究室提供。细胞接种于含10％小牛血清的RPMI 1640培养液，置37℃ 5％CO₂条件下培养，2～3d换液传代。

主要试剂

（1）Telomerase PCR ELISA试剂盒：购自德国Boehringer Mannheim公司。

（2）MTT：Sigma公司产品。

MTT显色法测定LTA对HL-60细胞的生长抑制作用：HL-60细胞以5×10⁴/ml接种96孔培养板，每孔100μl，重复3 孔，于37℃ 5％CO₂条件下培养24h ，换液，分别加入含不同浓度LTA的培养液，每孔200μl，继续培养至所需时间后，参照Saladowski^〔8〕的方法作MTT显色法测定，计算LTA对肿瘤细胞的抑制率。

端粒酶活性测定

（1）细胞处理：取对数生长期细胞，以10⁵/ml密度接种于100ml培养瓶内，加入含40μg/ml LTA的RPMI 1640培养液，置37℃ 5％CO₂培养1～5d。

（2）端粒酶提取：收集待测细胞，用台盼蓝拒染法计数，取10⁶个细胞于Eppendorf管内，用PBS洗涤2次，每次4℃ 3000×g离心10min。弃上清，加入200μl CHAPS裂解液，冰浴30min，4℃ 12000×g 离心20min，小心移取上清液于新的Eppendorf管，-80℃保存待测。

（3）RT-PCR扩增：按试剂盒说明书进行。取上述提取物2μl，反应混合液25μl，加入DEPC处理的无菌重蒸水至总体积50μl，并按以下步骤循环：25℃ 30min循环1次，94℃ 5min循环1次，94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 90s，循环30次，再经72℃ 10min后置4℃保存。