关键词：
大肠埃希菌；环丙沙星；gyrA基因；突变 【
摘要
】
目的
了解临床分离大肠埃希菌耐环丙沙星gyrA基因突变情况。
方法
用环丙沙星浓度梯度法试条检测临床分离大肠埃希菌最低抑菌浓度（MIC），聚合酶链反应(PCR)扩增gyrA基因喹诺酮耐药决定区，扩增产物片段长度为668 bp，用限制性内切酶HinfⅠ消化PCR产物，行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳。
结果
共检测大肠埃希菌41株，14株MIC在0.25～0.5 μg／ml的菌株，未检出耐药性突变位点；4株MIC在1～2 μg／ml的菌株（2株MIC为1μg／ml、1株为1.5 μg／ml，1株为2 μg／ml）均出现gyrA基因突变；耐药菌23株（1株MIC为16 μg／ml，其余≥32 μg／ml）也均发生gyrA基因突变。
结论
临床分离大肠埃希菌对环丙沙星耐药性与HinfⅠ酶切位点突变密切相关，低水平耐药菌株gyrA基因发生突变具有一定临床意义。
A gyrA gene mutation in clinical Escherichia coli
Zhang Junmin, Wu Jian, Zhao Liping, et al. Department of Microbiology, the General Hospital of PLA, Beijing 100853 【
Abstract
】
Objective
To study a gyrA mutation of clinical E.coli strains.
Methods
We used Ciprofloxacin Etest to detect the MIC values of clinical E.coli strains, then PCR to amplify the quinolone-determining region (QRDR) of the gyrA gene, and digest the PCR products (668 bp) with HinfⅠ and 8% polyacrylamide gel electrophoresis.
Results
Fourty-one strains of E.coli were detected. Fourteen strains with MIC 0.25～0.5 μg/ml exhibited no gyrA mutation, but 4 strains with MIC 1～2 μg/ml and 23 strains with MIC 16～23 μg/ml gyrA gene mutation.
Conclusion
There was a close relationship between the clinical quinolone-resistant E.coli strains and the loss of HinfⅠ sits in gyrA gene. The gyrA gene mutation found in low-level Ciprofloxacin resistant E. coli will be useful to manage these resistant strains. 【
Key words
】 E.coli Ciprofloxacin gyrA gene Mutation 近年来临床分离大肠埃希菌对喹诺酮类耐药性的显著上升趋势，引起了临床和微生物实验室的广泛关注。编码DNA旋转酶的gyrA或gyrB基因发生点突变被认为是产生耐药性的主要原因
［1］。用聚合酶链反应(PCR)－限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)检测大肠埃希菌gyrA基因突变位点，是一种简便、易行的方法
［2］。为此，我们利用此方法对临床分离大肠埃希菌gyrA基因突变情况进行了研究，现将结果报告如下。
材料与方法
一、材料
1.菌株：临床分离大肠埃希菌41株：23株为耐药菌，其中1株环丙沙星最低抑菌浓度(MIC)为16 μg／ml，其余22株MIC≥32 μg／ml；2株MIC分别为1.5 μg/ml和2 μg／ml；敏感菌16株，其中14株MIC在0.25～0.5 μg／ml，2株MIC为1μg／ml。同时也检测大肠埃希菌ATCC 25922。
2.环丙沙星浓度梯度法试条、药敏用培养基均为AB Biodisk产品。试条MIC结果按美国临床试验室标准化委员会1996年标准判断。环丙沙星MIC≤1μg／ml为敏感，MIC≥4μg／ml为耐药。
二、方法
1.DNA提取：按文献［3］进行，不做RNA消化，DNA溶于0.5ml TE缓冲液中待用。
2.PCR反应扩增：喹诺酮耐药决定区(QRDR)引物按文献［2］，引物1为5′-GAGGAAGAGCTGAAGAGCTCCT-3′，引物2为5′-CCGGTACGGTAAG-CTTCTTCAA-3′，由中国科学院微生物研究所基因工程中心合成。PCR体积25 μl：Tris-HCl 10 mmol/L，pH9.0、KCl 50 mmol/L、MgCl2 2.5 mmol/L、Triton X-100 0.1％、4×dNTPs各200 μmol/L北京宝秦克生物科技公司产品；引物0.5 μmol/L、Taq DNA聚合酶1UPromega公司产品。DNA模板5 μl。93℃预变性5分钟，93℃1分钟、55℃1分钟、72℃2分钟，共40个循环。最后72℃再延伸6分钟。1.5％琼脂糖凝胶电泳。
3.HinfⅠ酶切分析：方法按文献［4］进行，反应总体积20 μl：2 μl 10×反应缓冲液、10 μl PCR扩增产物、6 μl无菌水、2 μl HinfⅠ限制性内切酶（6U／μl，北京北方同正生物技术发展公司产品），8 000 r／min离心30秒，放37℃作用4小时，取10 μl消化产物行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，150V电压1.5小时。放含0.5 μg／ml溴化乙啶的1×TBE缓冲液染色30分钟，观察结果并照相。
结果
用PCR方法对41株大肠埃希菌及大肠埃希菌ATCC 25922QRDR进行扩增，经1.5％琼脂糖凝胶电泳证实，均扩增出一条片段长度为668 bp的产物。
对上述扩增产物用限制性内切酶HinfⅠ消化后行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果见附图。电泳结果显示环丙沙星MIC在0.25～0.5 μg／ml的大肠埃希菌及标准菌株，酶切后均为3条DNA带，表明这些菌株的HinfⅠ酶切位点未发生突变；而2株MIC为1 μg／ml的菌株、2株中介度的菌株以及所有耐药菌株，HinfⅠ酶切后则为2条DNA带，表明该酶切位
