牛泡沫病毒两类启动子活性的比较和机制探讨
牛泡沫病毒两类启动子活性的比较和机制探讨
中国病毒学 2000年第1期第15卷 简 报
作者：王世珍 张莉 刘佳建 刘淑红 陈启民 耿运琪
单位：南开大学生命科学院，天津 300071
关键词：牛泡沫病毒；长末端重复序列；内部启动子
分类号： Q75 文献识别码： A 文章编号： 1003-5125(2000)01-0093-04 Activity Comparison and Mechanism of Two Promoters of Bovine Foamy VirusWANG Shi-zhen, ZHANG Li, LIU Jia-jian, LIU Shu-hong, CHEN Qi-min, GENG Yun-qi
(College of Life Science, Nankai University, Tianjin 300071, China)
Abstract： Two promoters, LTR (long terminal repeat) and IP (internal promoter), exist in genomes of foamy viruses. Cell transfection and transient ex pression assay demonstrated that: the basal activity of BFV (bovine foamy virus ) IP is much higher than that of BFV LTR; transactivator of BFV—Borf-1, which activates gene expression directed by BFV LTR, also functions on BFV IP with an activation fold higher than that on LTR. The results suggest that BFV IP and LTR may regulate viral gene expression by different mechanisms, and that Borf-1 ma y stimulate BFV IP and LTR in different ways. In addition, an in vivo DNA competition assay demonstrated that a common transcription factor may be involved in both mechanisms of the two promoters. Key words ： Bovine foamy virus; Long terminal repeat; Internal promoter▲ 牛泡沫病毒(Bovine foamy virus, BFV)属反转录病毒科泡沫病毒属。其基因组两端为长末 端重复序列(Long terminal repeat, LTR)，中间部分除gag\,pol\,env三个结构基因外，还 有两个重叠的读码框ORF-1、2，起始于env基因3′端，终止于3′LTR，编码Borf-1、Borf - 2等多种调节蛋白［1～3］。其中Borf-1为BFV的反式激活因子，可显著激活BFV L TR启动子起始的基因表达。近年来，在泡沫病毒家族成员人泡沫病毒(Human foamy virus, HFV)和猴泡沫病毒(Simian foamy virus, SFV)1型、3型中，陆续发现了除5′LTR启动子 之外的第二类启动子［4～6］。该启动子位于env基因内部、调节蛋白编码区上游 ，称为内部启动子(Internal promoter, IP)。本实验室也已从BFV基因组的相应位置克隆到 了有活性的IP片段。本文通过瞬时表达，分析比较了BFV LTR和IP两类启动子的基础活性和 在B orf-1作用下的激活活性，并运用体内DNA竞争分析初步探讨了BFV两类启动子作用机制的异同。 1 材料与方法1.1 质粒构建 以本实验室分离鉴定的BFV3026中国毒株为材 料［7］，克隆到了含全长LTR的-55/1257片段、含全长IP的8564/9509片段 ，以及9538/10365 ORF-1片段(核苷酸按基因组全序列中编号，完整的原病毒cDNA中相 当于毒粒基因 组RNA5′端不完整LTR上游的核苷酸编号为负值)。将前两个片段连至pGEM-T载体(购自Prom ega公司)，得到pT-BFVLTR和pT-BFVIP，再将T载体上的LTR片段和IP片段取代本室保藏的 质粒pBIVLTR-luc［8］ (BIVLTR下游连有荧光素酶报告基因luc)中的BIVLTR，得到 报告质粒pBFVLTR-luc和pBFVIP-luc。将ORF-1片段取代质粒pRSV-cat(RSV启动子下游连 有报告基因cat)中的cat基因，得到Borf-1表达质粒pBFVORF-1。
1.2 细胞培养和转染 牛肺细胞系BL-12用补加10%胎 牛血清的DMEM培养基(购自GIBCO/BRL)，于37℃，5%CO2条件下培养。采用Lipofect AMI NETM试剂(购自GIBCO/BRL)，参用该试剂产品说明书上粘着细胞转染法转染细胞。六 孔板中每孔铺2×105个细胞，转染时每孔Lipofect (2mg/mL)用量3μL，不同DNA的用 量见结果与讨论部分。
1.3 荧光素酶活性测定 转染48h后裂解细胞， 使用 荧光素酶检测试剂盒(购自Promega公司)，在生物化学发光测量仪(购自上海检测技术所)上 测定荧光素酶活性(方法参见该试剂盒操作说明)。
2 结果与讨论 2.1 基础活性比较 分别以不同用量的pBFVLTR-luc和pBFVIP-lu c转染BL-12细胞系，通过检测被相同用量的pBFVLTR-luc和pBFVIP-luc转染后细胞所表达 的荧光素酶活性，比较BFV LTR和IP的基础活性。结果如表1所示。在相同用量下pBFVIP- lu c比pBFVLTR-luc转染细胞所得的luc活性高得多，说明BFV IP的基础活性远远高于BFV LTR 。BFV LTR的基础活性很低，说明在无反式激活因子存在的情况下，它几乎不表现启动子活 性。这一点与HFV、SFVs LTR研究结果是一致的。 表1 BFV LTR和IP的基础活性a Table 1 Basal activity of BFV LTR and IPa| 报告质粒 Reporter plasmids | 不同报告质粒用量下的荧光 素酶活性 Luc activities when transfected with various doses of reporter | ||||
| 0μg | 0.1μg | 0.2μg | 0.5μg | 1μg | |
| pBFVLTR-luc | 10 | 11 | 12 | 18 | 27 |
| pBFVIP-luc | 10 | 163 | 470 | 781 | 1956 |
