小鼠2-5A合成酶cDNA克隆及全序列测定
小鼠2-5A合成酶cDNA克隆及全序列测定
中国病毒学 2000年第1期第15卷 研究报告
作者：彭日荷 姚泉洪 黄晓敏 范惠琴 张大兵 蒋琳
单位：上海市农业科学院植物保护研究所，上海市遗传育种重点实验室，上海 201106)
关键词：小鼠；2-5A合成酶基因；克隆；序列测定
摘 要： 通过饲喂放线菌酮，提取小鼠肝脏的总RNA，反转录合成cDNA第一链，利用RT-PCR扩增出1100bp大小的片段，将其克隆入载体pBluescript，采取双链质粒直接测序，获得的序列与国外报道小鼠2-5A合成酶基因序列具99.8%的同源性。氨基酸序列分析表明，小鼠2-5A合成酶与人2-5A合成酶具68%同源性，并在其C端发现亲水基团和糖基化位点。 分类号： Q78 文献标识码： A 文章编号： 1003-5125(2000)01-0073-05 Molecular Cloning and Sequencing of Murine 2-5A Synthetase cDNAPENG Ri-he, YAO Quan-hong, HUANG Xiao-min,FAN Hui-qing, ZHANG Da-bing, JIANG Lin
(Institute of Plant Protection in Shanghai Academy of Agricu ltural Science, Shanghai Key Laboratory of Genetics and Breeding, Shanghai 201106, China)
Abstract： The 2-5 oligoadenylate system provides a universal response in mammals. 2-5A synthetase polymerizes ATP to a series of 2-5 oligoadenylate (2-5A). 2-5A activates a latent endoribonuclease (RNase L) which degrades viral RNA. In this paper the result of cloning and sequencing of the murine 2-5 oligoadenylate gene was reported. There are three different points between the nu cleotide sequence of the cloned murine 2-5 oligoadenylate gene.The amino acid homology of murine 2-5A synthetase with human 2-5A synthetase was 68%. The C- terminal portion of murine 2-5 A synthetase containes a hydrophilic region and a possible glycosylationsite. Key words ： Murine; 2-5A synthetase; Cloning; Sequence analysis▲ 在哺乳动物体内，干扰素具有广泛的生物功能，它能抗癌，抗病毒，对细胞分裂、分化、细 胞膜的透性以及免疫系统都有影响［1］。当细胞受到病毒侵染后，诱导产生干扰素 ，干扰素刺激细胞诱生多种抑制mRNA翻译的酶类，其中2-5A合成酶和RNAase L 与干扰素的 关 系最为密切［2］。2-5A合成酶只有在dsRNA存在下才具有活性，它催化由ATP合成2 ′-5′寡聚腺苷酸(2-5A)，2-5A再激活细胞内的RNAase L，从而降解病毒和细胞内的RNA s［3，4］。 我们根据小鼠2-5A合成酶基因序列设计引物［5］，利用RT-PCR方法，从小鼠的肝 脏中扩增并克隆该基因，采用双链DNA荧光法测定了其序列。 1 材料和方法 1.1 质粒、菌种宿主菌DH5α、质粒pBluescript为本室所保存。
1.2 化学试剂和酶类反转录酶、限制性内切酶、Klenow酶、T4DNA连接酶、质粒纯化柱为Promega公司产品，DNA 聚合酶Tag PlusⅡ购自加拿大Sangon公司，DNA序列测定试剂盒为美国ABI公司产品，其它主 要化学试剂为美国Sigma公司或国产AR级试剂。PCR引物由中国科学院上海植物生理所合成。
1.3 总RNA的提取昆明种10周龄雌性小鼠，体重为25～30g，每只饲喂80μg/mL的放线菌酮约50μL，同 时在皮下注射人α干扰素(IFNα2b)1000 IU，2h后，取肝脏放置研钵中边加液氮边研细， 直至粉末状，总RNA的提取采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿抽提法［6］。
1.4 基因PCR扩增以总RNA为模板，Oligo(dT)为引物，参照Promega公司cDNA合成产品说明。在AMV反转录酶作 用下合成cDNA第一链后，以此为模板进行PCR扩增，两端引物分别为：
5′端： AAAGGATCCAACAATGGCGCACGGACTCAGGAG
3′端： AAAGAGCTCTTACAGCAGGATACATGTCC
扩增条件为94℃变性40s，57℃退火90s，72℃延伸120s，共进行30个循环。
1.5 DNA序列分析采取双链质粒直接测序方法，双脱氧核苷酸终止法测定序列。用ABI PRISM Dye Terminator DNA测序试剂盒，用Promega质粒纯化柱提纯质粒，在ABI 373型DNA自动化荧光测序仪上进 行双链DNA序列测定。
2 结果 2.1 PCR产物鉴定及克隆PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检查，扩增片段大小约为1100bp(图1)，剩余产物经酚∶ 氯 仿(1∶1)提抽，乙醇沉淀回收后，Klenow酶补平，pBluescript载体EcoR V酶切，两片段连 接，转化DH5α，获带2-5A合成酶基因的克隆(图2)。
