斜纹夜蛾核型多角体病毒p74基因的克隆和序列分析
斜纹夜蛾核型多角体病毒p74基因的克隆和序列分析
中国病毒学 2000年第1期第15卷 研究报告
作者：杨洁 龙綮新 吴文言 王珣章
单位：杨洁(第一军医大学南方医院传染科，广州 510515)；龙綮新 吴文言 王珣章(中山大学昆虫所，生物防治国家重点实验室，广州 510275)
关键词：斜纹夜蛾核型多角体病毒(spltNPV)；p74基因；基因克隆；序列测定
摘 要： 用AcNPV p74基因3′端的1.4kb片段，通过Southern blotting将SpltNPV的p74基因定位于XhoI(4 .9kb)、EcoRI(4.4kb)、BamHI(3.0kb)片段上。进一步用ExoⅢ和构建亚克隆测序法， 对长2545bp的p74基因进行了序列分析，其中1974bp的编码区编码658个氨基酸，蛋白分子量约75.87kD，其编码蛋白与AcMNPV和CfMNPV p74蛋白的氨基酸序列同源性分别为64%和63%。 分类号： Q7.756 文献标识码： A 文章编号： 1003-5125(2000)01-0045-07 Sequencing of the p74 Gene of Spodoptera litura Multinucleocapcid Polyhedrosis VirusYANG Jie, LONG Qing-xin, WU Wen-yan, WANG Xun-zhang
(Institute of Entomology and State Key Laboratory for Biological Control,
Zhongshan University, Guangzhou 510275, China)
Abstract： The p74 gene of SpltNPV was loc ated at EcoRI-4.4 kb，XhoI-4.9 kb and BamHI-3.0 kb fragments by Southern blot ting with AcMNP V-derived probe. After cloning of the three fragments, restriction enzyme analysis was used to construct their restriction map. A region of 2545 bp including p74 gene of SpltNPV was sequenced. The open reading frame of SpltNPV p74 gene was decided to be 1974 bp long, which codes 658 aminoacids. Comparison of the homology with other baculovirus p74 genes shows that SpltNPV p74 is 64% and 63% identical to that of AcMNPV and CfMNPV at the amino acid level. Key words ： SpltNPV; p74 gene; Gene cloning; Sequencing▲ 昆虫杆状病毒作为一种无公害生物杀虫剂越来越得到广泛的应用，但是昆虫杆状病毒的宿主专一性较强，杀虫谱较窄，已成为限制其更广泛应用的一个重要因素。如何扩大其宿主范围，提高毒力，是应用杆状病毒防治害虫所面临的重大课题。p74基因作为与昆虫杆状病毒侵染力有关的基因，其基因产物与杆状病毒在感染昆虫幼虫时与中肠的特异性吸附有关［1，2］，这种吸附可能具有种的专一性，因而p74基因可能是决定杆状病毒宿主专一性的一个重要因素。所以研究不同杆状病毒之间p74基因的结构及功能的异同，具有重要的意义。斜纹夜蛾(Spodoptera litura)是危害多种农作物的重要害虫，主要分布于中国南部、 东南亚地区和日本西南部。本研究在斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera litura nuc lear polyhedrosis virus, SpltNPV) p74基因定位的基础上进 行序列分析，并将所测序列与苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multinucleocapsid nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV)和枞色卷蛾核型多角体病毒( Choristoneura fumiferana multinucleocapsid nuclear polyhedrosis virus, CfMNPV) ［3］的p74基因进行了核苷酸同源性和编码蛋白的氨基 酸序列同源性比较。 1 材料与方法 1.1 病毒、菌株和质粒斜纹夜蛾核型多角体病毒中山大学分离株(Zhongshan University isolate, ZSU)［4 ］由本室保存，苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒由美国加州大学Federici B.A.教授提供， 载体质粒用pBluescript M13(-)和pUC18，受体菌株为E.coli DH5α。
1.2 病毒基因组DNA的制备参考Summers M.D.和Smith G.E.的方法［5］，从病毒多角体中提取病毒基因组DNA 。
1.3 核酸杂交探针的制备由于AcMNPV的EcoRI-P片段含有大部分p74基因(2.0kb)［ 6］，遂用pBluscript M13(-)克隆该片段，并经EcoRI和HindⅢ双酶切回收含p74基因3′端的1.4kb片段。按Boeringer Mannheim Biochemica公司的‘ DIG DNA Labeling and Detection kit’说明书标记探针。
1.4 Southern blotting及杂交片段的克隆用上述标记的探针在宽松条件下(5×SSC,56℃，无甲酰氨)与SpltNPV基因组DNA的EcoRI、 BamHI和XhoI酶切片段杂交，按试剂盒说明进行显色。然后用pBluescipt M13(-)和pUC18克 隆阳性片段。具体方法参考文献［7］。克隆有杂交片段的质粒分别命名为pBluep74-E、pB 1up74-B、pBlueP74-X。
