GST融合蛋白在杆状病毒系统中表达的可溶性研究
GST融合蛋白在杆状病毒系统中表达的可溶性研究
中国病毒学 2000年第2期第15卷 研究报告
作者：杨林 李国清 黄葆英 王全忠 龙綮新 王珣章
单位：杨林(中山大学生物防治国家重点实验室、生物医药中心，广州 510275)；李国清(华南农业大学动物医学系，广州 510640)黄葆英 王全忠 龙綮新 王珣章(中山大学生物防治国家重点实验室、生物医药中心，广州 510275)
关键词：GST融合蛋白；杆状病毒表达系统；可溶性分析
摘要：将构建好的可表达GST融合蛋白的重组病毒AcMNPV-OCC--GST-6xHis-Etp28感染Sf9细胞，一定时间后取感染了病毒的细胞裂解物上清液进行SDS-PAGE分析，结果显示53kDa的融合蛋白(GST-6xHis-Etp28)呈不溶状态。在原有裂解液的基础上，加固体十二烷基肌氨酸钠至终浓度1.5%，并将Triton X-100的比例由1%提高到2%。SDS-PAGE结果显示至少有1/3的GST-6xHis-Etp28处于溶解状态，可溶性GST-6xHis-Etp28经亲合层析，53kDa的目标蛋白得到纯化。
中图分类号：Q939.4，Q786 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)02-0143-06
Solubilization Analysis of GST Fusion Protein Expressed in Baculovirus SystemYANG Lin,HUANG Bao-ying,WANG Quan-zhong,LONG Qing-xin,WANG Xun-zhang
(State key Lab for Biological Control,Biopharmaceutical Center,Zhongshan University,Guangzhou 510275,China)
LI Guo-qing
(Department of Animal Medicine,South China Agricultural University,Guangzhou,510640,China)
Abstract:Insect Sf9 cells were infected with constructed recombinant virus AcMNPV-OCC--GST-6xHis-Etp28,which could produce GST fusion protein and the supernatant of 72 h pi cell lysate was examined by SDS-PAGE.The results showed that GST-6xHis-Etp28 fusion protein of 53 kDa was expressed in insoluble status.After the sodium salt of the alkylanionic detergent sarkosyl was added to insect cell lysis buffer to a final concentration of 1.5%,and the final concentration of TritonX-100 was increased from 1% to 2%,at least 1/3 of GST-6xHis-Etp28 appeared to be soluble,which was examined by SDS-PAGE.Then soluble GST-6xHis-Etp28 was purified by affinity chromatography using glutathione agarose.
Key words:GST fusion protein; Baculovirus expression system; Solubilization analysis
自从1983年Smith和Summers首次利用苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)表达人β-干扰素以来，至今已有数百种外源基因在杆状病毒载体系统中得到表达。由于杆状病毒载体表达系统具有较完备的翻译后加工修饰系统，如糖基化、磷酸化、蛋白酶特异性水解(如切除信号肽)和酰胺化等，还具有高效表达外源基因的能力，因此杆状病毒载体系统已成为最有应用前景的真核基因高效表达载体之一。
在应用杆状病毒系统进行外源基因的表达时，一个常用的转移载体是GST融合载体，这类载体将表达出GST融合蛋白。GST与还原型谷胱苷肽具有高度亲合性，因此可通过简便、高效的亲合纯化进行外源蛋白的分离纯化；此外，抗GST抗体可以对融合蛋白中的GST进行检测，从而使那些无法获得抗体的外源蛋白的检测成为可能。
应用原核系统表达GST融合蛋白时，往往会得到不可溶的表达产物［1］，这就给表达产物的纯化、活性保证等带来了困难。本研究探讨了GST融合蛋白在杆状病毒系统中表达的可溶性状况，并进行了解决可溶性问题的研究。
1 材料和方法 1.1 材料1.1.1 重组病毒 重组病毒AcMNPV-OCC--GST-6xHis-Etp28［2］由本室构建。
1.1.2 昆虫细胞、病毒和病毒基因组DNA 含合成启动子和β-半乳糖苷酶基因的无包涵体粉纹夜蛾重组株(TnNPV-SVI-G)由本室构建［3］，草地夜蛾(Spodoptera frugiperda 9,Sf9)昆虫细胞引自英国自然环境研究会病毒研究所。
1.1.3 其它生化试剂 Glutathione Agarose Beads、Glutathione Powder、昆虫细胞裂解缓冲液(1×)、蛋白酶抑制剂混合物(50×)购自PharMingen公司。Acrylamide、Bis-acrylamide购自Sigma公司。
1.2 方法1.2.1 病毒扩增
大量培养Sf9细胞，待细胞长成单层处于对数生长期时用于病毒感染。具体操作包括：吸弃培养基，接种病毒，使病毒感染复数(MOI)小于1。室温吸附1h后除去病毒接种物，换以新鲜培养基，27℃培养48～72h，收集上清待用。
1.2.2 表达产物的检测
1.2.2.1 病毒定量感染和样品制备 接种2×106个处于对数生长期的Sf9细胞至25cm2细胞培养瓶中，使用高滴度病毒原液，病毒滴度(PFU/mL)至少为1×108有效病毒粒子/mL，且病毒感染复数(MOI)控制在5～10之间。病毒接种细胞吸附1h后，弃病毒液，换以新鲜的培养基27℃培养72h后，移弃培养基，预冷的PBS(pH7.4)缓冲液洗涤细胞数次。除尽残留液体，再加入500μL预冷的细胞裂解液(含有1×Protease inhibitor cocktail)，用橡皮刮刮下细胞收集至eppendorf管内，置冰浴裂解45min，每50μL细胞裂解物分装至一个eppendorf管中，置于-20℃或者-80℃贮存备用或直接用于表达情况分析。
