HIV-1 p24蛋白在大肠肝菌中的高效可溶性表达、一步纯化及抗原性分析
HIV-1 p24蛋白在大肠肝菌中的高效可溶性表达、一步纯化及抗原性分析
中国病毒学 2000年第2期第15卷 研究报告
作者：童贻刚 杜勇 徐静 李敬云 鲁晏希 鲍作义 王海涛
单位：军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071
关键词：人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)；p24蛋白；基因表达；大肠杆菌
摘要：合成引物扩增HIV-1 p24基因，并将其克隆到pQE-30质粒中，使其在大肠杆菌E.coli M15中以IPTG诱导高效表达，经SDS-PAGE分析，该表达产物约占菌体总蛋白20%，并且以可溶蛋白的形式存在于细菌裂解液上清之中。经镍离子柱亲和层析一步纯化，洗脱产物中p24蛋白纯度达95%。ELISA分析表明，该蛋白可与HIV感染者血清发生特异性免疫反应。以此蛋白交联Sepharose 4B，亲和层析纯化HIV感染者血清中的抗体，用所得抗体与HIV确认试剂反应，发现该纯化抗体仅与确认试剂中的p24蛋白反应。上述结果表明在大肠杆菌中已经高效表达了可溶性HIV-1 p24蛋白，该蛋白具有良好的抗原性。
中图分类号：R512.91 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)02-0116-06
High Level Soluble Expressiion,One-Step Purification and Characterization of HIV-1 p24 ProteinTONG Yi-gang,DU Yong,XU Jing,et al
(Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071,China)
Abstract:The HIV-1 p24 gene (gag gene) was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into an E.coli expression vehicle pQE30 between BamH I and Kpn I sites.After induction with IPTG,the transformed E.coli strain M15 expressed the HIV-1 p24 gene efficiently.The recombinant p24 protein was expressed as a soluble protein,composing 20% of the total protein.After onestep purification with Ni-NTA+ affinity chromatography,the protein was purified to almost homogeneity.When applied to ELISA,the p24 protein exhibited good specific reactivity with sera of HIV-infected individuals.The antibodies against recombinant p24 protein from HIV infected plasma were purified and confirmed with HIV Western blot kit that the purified antibodies can only react with HIV-1 p24 antigen.It suggests that the recombinant HIV-1 p24 protein is suitable for assembling the HIV diagnostic kits.
Key words:Human immunodeficiency virus type-1; p24 protein; Gene expression; E.coli
原核表达系统是生产蛋白抗原的一种最为经济的手段，目前许多诊断试剂所用的抗原都是由大肠杆菌表达的。但是在高效表达的同时，目的蛋白往往会形成包涵体，这对蛋白的天然结构和抗原活性造成很大的破坏，而使包涵体中的变性蛋白溶解和复性往往是一个非常费时且效率很低的过程，经常会导致重组蛋白的大量损失。本文报道了在大肠杆菌中高效表达完整的可溶性HIV-1 p24蛋白，并且经一步纯化即可得到纯品。这为大规模生产HIV诊断试剂用p24蛋白提供了可靠保障。
1 材料与方法 1.1 质粒与菌种 含HIV-1全长基因组的质粒pHIV由本室保存，该HIV-1基因组为HIV-1毒株NY5和LAV重组的前病毒基因组［1］。质粒pQE30及其受体菌E.coli M15购自Qiagen公司。 1.2 血清和血浆来源 所有血清和血浆均由全军艾滋病检测中心提供，其艾滋病感染状况经过该中心的鉴定。这些血清和血浆均来自河北省固安县献血员。 1.3 引物设计及PCR扩增 根据HIV-1的序列，用OLIGO 4.0软件辅助设计一对引物，正向引物prm12:GAGGATCCCCCATAGTGCAGAACCTC。反向引物prm13:CCGGTACCTTAGAAAACTCTTGCTTTATG。PCR反应参照《分子克隆》［2］进行，反应总体积50μL，含50mmol/L KCl,10mmol/L Tris。 Cl(室温下pH8.0)，15mmol/L MgCl2,0.2mg/mL牛血清白蛋白，0.1%NP40，dNTP各200μmol/L，引物各1μmol/L，模板质粒pHIV 10ng，Taq DNA聚合酶2单位。94℃预变性3min后，按如下方式进行30次循环：94℃ 60s，58℃ 60s,72℃ 90s，最后在72℃延伸5min。 1.4 HIV-1 p24基因的克隆 将上述PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，用低熔点胶进行纯化［2］，然后以BamH I/Kpn I双酶切，与以BamH I/Kpn I双酶切的载体pQE30连接，转化E.coli M15。快速筛选阳性克隆的方法如下：预先制备PCR反应液(配方同上，含缓冲液，dNTP,prm12,prm13,Taq酶，但不含模板DNA)，分装成小管，每管25μL。在转化平皿背面给待筛选的克隆标记号码，以吸头挑取菌落冲洗到PCR反应管中，按照上述的PCR方法进行PCR反应。 1.5 HIV-1 p24基因在大肠肝菌中的表达