草鱼呼肠孤病毒在CIK细胞中复制及形态发生的研究
草鱼呼肠孤病毒在CIK细胞中复制及形态发生的研究
中国病毒学 2000年第2期第15卷 研究报告
作者：邹桂平 方勤
单位：邹桂平 方勤(中国科学院武汉病毒研究所，武汉 430071)
关键词：草鱼呼肠孤病毒(GCRV)；草鱼肾细胞系(CIK)；形态发生
摘要：以草鱼呼肠孤病毒(GCRV)感染的草鱼肾细胞系(CIK)为模型，进行了草鱼呼肠孤病毒在细胞内的形态发生的研究。当病毒以感染复数为5～10PFU/CELL感染CIK细胞时，在病毒感染细胞4h以内的切片中，可观察到脱去部分外层衣壳的不完整病毒颗粒。感染细胞8h，可观察到浆胞内病毒发生基质，其内含有大量的直径约50nm的亚病毒颗粒，无外层蛋白结构。感染12～16h后，这些亚病毒颗粒装配上外层蛋白结构，形成直径为72nm左右的成熟的病毒粒子。病毒感染细胞8h后，开始出现典型的病毒包含体，16～20h小时病毒包含体裂解，继而释放出有感染性的子代病毒颗粒。该结果有助于对GCRV致病机理的了解。
中图分类号：Q943.112 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)02-0188-05
Study on Replication and Morphogenesis of the Grass Carp Reovirus (GCRV) in CIK CellsZOU Gui-ping,FANG Qin
(Wuhan Institute of Virology,Academia Sinica,Wuhan 430071,China)
Abstract:The morphogenesis of the Grass Carp Reovirus (GCRV) was studied in CIK cells.The CIK cells were infected by the GCRV at MOI (multiplicity of infection) of 5-10 PFU/Cell.It was demonstrated that the subviral particles without outer layer proteins could be seen in the cytoplasm at 4 hours post infection.At 8 hours post infection many viroplasms could be found in the cytoplasm of the cells.And there were many subviral particles without outer layer proteins in them.As the infection progressed,the mature virus,which is about 72 nm in diameter produced after the subviral particles were transiently enveloped during 12-16 hours post infection.During its replication,at 8 hour post infection inclusion bodies were formed,in which there were many immature and mature viruses.And the progeny virions were released after the inclusion bodies lysised at 16-20 hours post infection.
Key words:Grass carp reovirus (GCRV); Ctenopharyngodon idellus kidney cell (CIK cell); Morphogenesis
草鱼呼肠孤病毒(GCRV)为呼肠孤病毒科新建水生呼肠孤病毒属一成员［1］，亦是我国分离鉴定的第一株鱼类病毒［2，3］。十多年来，我们对其形态、病毒基因组结构、细胞培养特性、多肽的基因定位、cDNA文库构建及序列分析等［3～7］进行了研究，特别是对GCRV的RNA聚合酶的序列分析及同源性比较研究［8］，为进一步揭示GCRV分子致病机理奠定了良好的基础。病毒复制是一系列连续有序的生物合成过程，而细胞是病毒转录复制的重要场所。要了解GCRV的致病机理，首先必须建立一个适合于GCRV研究的细胞实验系统。我们在对GCRV细胞培养特性研究中，建立了高滴度病毒培养方法［4］。这一方法的建立，无疑为对GCRV的复制与形态发生研究奠定了良好条件。本研究通过对GCRV感染草鱼肾细胞系(CIK)不同时间取样超薄切片的电镜观察，阐明了GCRV在CIK细胞内的形成过程，下面报道本实验的研究结果。
1 材料和方法 1.1 细胞培养、病毒增殖及滴价测定实验所用CIK细胞系，由本实验室提供；病毒为本实验室传代的GCRV-873株［2］。细胞培养、病毒增殖及滴价测定按文献进行［4］。
1.2 用于超薄切片制备的细胞感染实验挑选对数生长期的CIK细胞进行病毒感染，病毒的感染复数为5～10PFU/CELL，GCRV吸附细胞时间为60min。吸附后，倾去病毒液，用PBS漂洗单层细胞三次，以洗去未吸附的病毒粒子，然后加入含2%小牛血清的Eagle's MEM培养基(MEM-2)，置28℃培养。此后，在0.5、1、2、4、8、12、16、20、24、36、48h取样。离心沉淀病毒感染的细胞培养物，用2.5%戊二醛室温下固定一小时后，置4℃保存备用。
1.3 电镜超薄切片的制备取4℃固定好的样品，用PBS漂洗细胞，然后用1%的OsO4溶液固定1h，50%、70%、95%、100%乙醇梯度脱水，Epon812包埋，60～65℃下聚合2～3d。包埋块在LKB-2128型超薄切片机上切制，常规醋酸铀，枸橼酸铅双染色，样品在日立H-7000FA型透射电镜下观察，照相与分析。
2 结果与讨论 2.1 GCRV的形态发生过程在GCRV吸附CIK细胞60min后，分别在0.5、1、2、4、8、12、16、20、24、36、48h收获感染病毒的细胞。电镜观察在感染细胞0.5至4h的切片中，相似的病毒粒子进入细胞的过程(图1)。从图中可以看到，这些病毒形态不很完整，因病毒进入细胞后与溶酶体结合，其水解酶类使毒粒外衣壳水解而形成亚病毒颗粒(SVP)。因为该病毒的转录与复制是在亚病毒颗粒中进行的，病毒核心内含有RNA多聚酶等病毒早期转录、复制的酶类，故脱壳过程有助于病毒的转录与复制。此外，大多数新合成的单链RNA分子可通过核心上的钉状物通道离开亚病毒颗粒［9］，很快与胞浆中的核糖体结合，在核糖体上翻译产生不同的蛋白质，以进行子代病毒的复制及包装，这一过程与病毒的复制需要连续的蛋白合成是极相适应的。从图2可见，病毒感染细胞8h后，即可在CIK细胞的细胞质中观察到病毒发生基质，基质中存在大量未装配成熟的亚病毒颗粒(图3)。在病毒感染细胞12～16h时，新复制的病毒粒子逐渐包装成熟，最后细胞裂解导致成熟的病毒粒子释放(图4)。
