医学检验信息网 检验医学 2007-2-9 13:10:37

关键词： 分枝杆菌结核；抗药性；微生物；DNA突变分析 【摘要】 目的 研究耐多药结核分枝杆菌katG、inhA基因的变异机理。方法 用katG、inhA基因片段为引物，聚合酶链反应扩增产物，克隆后制备质粒，直接测定DNA序列。结果 15株耐异烟肼菌株均有katG基因突变，主要为点突变，其中14株有463位和315位AA密码子改变。在18个耐异烟肼菌株中，全部出现基因inhA基因变异，主要为点突变和缺失，以单个位点变异为主，各菌株变异不同。katG、inhA基因同时出现变异的比例高。结论 结核分枝杆菌耐药基因变异复杂，我国耐多药结核菌株与国外的菌株katG、inhA基因变异特点不同。 Direct sequencing for katG and inhA genes of multi-drug resistant isolates of mycobacterium tuberculosis

ZHU Zhongyuan,CHEN Yiping, CHEN Yunfeng, et al.

（Workers′ Hospital of Hainan Province, Haikou 570311, China）

【Abstract】 Objective To characterize the katG and inhA genetic variations in multi-drug resistant isolates of M. tuberculosis. Methods The amplicons were cloned and sequenced by ABI 377 automatic sequencing system. Results All isolates of M. tuberculosis with MIC for INH ≥1 μg/ml had point mutations and insertion in katG gene. Fourteen of 15 isolates (86.7%) had 463 codon (Arg→Leu) and 315 (Ser→Asn/Thr) mutations. Nine of 13 mutation positions were not reported previously. All 18 isolates with MIC≥1 μg/ml had one or more variations in inhA. The variations consisted of one or more base pairs deletions or point mutation. Each strain had its unique mutation. Seven of 10 isolates had both katG and inhA mutations. Conclusion Genetic variants of M. tuberculosis are significantly different from those of foreign strains. 【Key words】 Mycobacterium tuberculosis;drug resistance microbial;DNA mutational analysis 结核病的发病率和病死率在许多国家呈上升趋势，并出现耐多药结核分枝杆菌(结核菌)株，危害十分严重。从分子水平阐明结核菌耐药性变异的机理，可为建立敏感、快速和特异的检测方法奠定基础。katG基因全部缺失和点突变等引起结核菌产生对异烟肼（INH）耐药^［1,2］；将katG基因导入耐INH菌株可恢复其对INH的敏感性^［3］。表明katG基因与结核菌对INH的敏感性关系密切。其他研究也证实结核菌对INH和乙胺丁醇（EMB）的敏感性与inhA基因突变有关^［4］。我们采用直接测序法分析了从两城市结核菌耐多药株的katG、inhA基因，发现了多个新变异位点。 材料与方法

一、材料

1.菌株：结核菌H37Ra和H37Rv由湖北医科大学微生物学教研室提供。BCG从兰州生物制品研究所的卡介苗中分离。结核菌分离株68株。其中本院分离25株；武汉钢铁公司第二医院梅国华主任赠送38株；解放军187医院提供5株。

2.试剂和仪器：ABI 377型DNA测序系统和基因扩增仪为美国PE公司产品；BACTEC 460 TB型细菌检测仪和12B培养基为BD公司产品；pGEM T easy 载体为Promega公司产品；Dye Primer测序试剂盒为PE公司产品；聚合酶链反应(PCR)体系为华美生物工程公司产品。

二、方法

1.药敏试验：药物溶解后，除菌，注入12B培养基中，使INH和PAS的终浓度为1和10 μg/ml，利福平为50和250 μg/ml，链霉素为10和100 μg/ml，EMB为5和50 μg/ml。然后将生长良好的结核菌刮下，研磨成悬液，加入上述12B培养基中，并加1瓶不含药物的12B作为对照。结核菌浓度为1 μg/ml。37℃培养10天，每天在细菌检测仪测定生长指数，当试验瓶与对照瓶内的指数增长趋势一致时为耐药；相对稳定或呈下降趋势时为敏感。

2.DNA提取：溶菌酶和蛋白酶K裂解细菌后，苯酚氯仿纯化。

3.引物设计：katG、inhA基因的两对引物我们根据文献［1，2］（EMBL：x68081和Genbank: u02492）的序列自主设计，由中国科学院微生物研究所合成并纯化。KG1和KG2扩增katG基因2 681～3 721位碱基序列，长度为1 041 bp。IA1和IA2扩增inhA基因16～805位DNA片段，长度为790 bp，占inhA基因总长的96.1%。

4.基因扩增：100 μl反应体积内含2种引物各2 μl，PCR缓冲液10 μl，dTNPs(2 mmol)10 μl，模板5 μl，Taq 酶3 U，95℃预变性5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，循环35次，72℃ 7 min。

5.序列分析：根据文献［5］改进。PCR产物提纯后，与pGEM载体连接，转染给DH5α，经蓝白菌斑筛选和EcoRⅠ酶切鉴定，再制备质粒，纯化后与测序试剂反应、测序。正反方向测序，中间的50～100 bp双向均可测到。新变异位点都经重复试验证实。

结果

1.结核菌的最低抑菌浓度(MIC)：68株结核菌分离株中，20株为耐药株（29.4%）。其中耐1种药物1株（1.5%），耐2种药物4株（5.9%），耐2种以上药物15株（22.0%）。只有1株耐INH的MIC≤1 μg/ml。绝大多数为多耐药株。

责任编辑: 参与评论