分枝杆菌感染的分子生物学诊断技术进展
分枝杆菌由结核分枝杆菌复合群和非结核性分枝杆菌组成，目前已知的分枝杆菌种类已达到90种[1]，其中包括致病菌，机会致病菌和非致病性分枝杆菌三类。在分枝杆菌属当中，最重要的种类当属结核分枝杆菌，它是结核的病原菌。结核病（TB）是目前世界上首要的感染性疾病，每年有800万人感染结核，有200万人死于结核病[2]。鸟分枝杆菌是临床最常见的非结核性分枝杆菌中的一种，尤其好发于AIDS患者[3]。
资料显示，随着ADIS疾病的出现，医源性免疫抑制的发生率增高，非结核分枝杆菌疾病发生率也在不断增加，且所占感染比例有不断上升的趋势[4]。尤其当患者伴随免疫缺陷状态时，我们发现许多以前认为是非致病性的分枝杆菌现在表现为致病菌，尤其是一些罕见的分枝杆菌，随之而来的是新的分枝杆菌种类的发现。结核与其他分枝杆菌疾病最主要的区别在于结核通过人与人之间传播，而其他分枝杆菌存在于自然界。根据分枝杆菌种类的不同，相应抗生素的敏感性也有所不同。因此我们需要快速敏感的分子生物学技术快速诊断并提供有效治疗方案。本综述回顾了近十年来分枝杆菌分子生物学诊断技术的最新进展及其意义。
一、临床标本中分枝杆菌的分子水平检测
传统诊断临床标本的分枝杆菌感染是基于镜下抗酸染色，进而特殊培养及生化实验鉴定菌种，最后检测药物敏感性。抗酸染色只能鉴别属与属外的特征，且只有在标本带菌量在104 ~ 106/ml时才能看见。由于多数分枝杆菌生长缓慢，鉴别到属的水平需要耗时4 ~ 8周，随着分子生物学的发展，现在有了比传统检验更可靠的菌种诊断和鉴定技术，诊断所需时间由数周减少到数天。
1. PCR：单纯PCR技术最初仅限于对临床痰标本中的结核分枝杆菌进行检测，根据结核分枝杆菌特有的IS6110插入序列设计特异引物，最后根据扩增出的目的片段来判断阳性结果[5]。Kwon等[6]进一步将PCR技术应用拓展到福尔马林固定的病理蜡块，针对病理表现为淋巴肉芽肿的病理组织标本，利用分枝杆菌通用引物（目的片段383 bp）和结核分枝杆菌复合群特异引物（目的片段123 bp）。在20例标本中有10例经通用引物扩增显示阳性，7例两组引物扩增结果均为阳性。对于那些临床怀疑淋巴结核但涂片和培养阴性的患者提供了分枝杆菌感染的证据。PCR技术的应用无疑大大缩短了实验周期，且操作简便，但是单纯通过扩增产物在凝胶板上的迁移判定扩增的阳性与否还是不够可靠，实际上，即使片段长度的等同也不应认为扩增产物就是目的片段，而应在片段长度和序列同源性两个方面同时得到确认。
2. PCR结合探针杂交：Kirschner等[7]以16SrRNA为靶基因设计分枝杆菌属的通用引物：Primer264 (5’-TGCACAGGCCACAAGGGA-3’) Primer285（5’-GAGTTTGATCCTTGGCTCAGGA-3’），可同时扩增非结核性分枝杆菌。在PCR的基础上，利用一系列特异性探针与扩增产物杂交反应进行种间区分。该实验中PCR的敏感性为84.5%，特异性为99.5%。值得一提的是Kirschner的研究中涉及到除了痰标本以外的各种组织标本的处理，如软组织、骨髓、尿液及脑脊液等，但遗憾的是在培养阳性的标本中PCR出现可观的假阴性结果。Kox 等[8,9]在1995年以16S rRNA为靶基因设计分枝杆菌属的通用引物扩增临床标本，扩增产物与9种特异性探针斑点杂交，同时鉴定9种分枝杆菌。Stauffer等[10]介绍了多重PCR体系快速检测分枝杆菌的实验方法，在应用16S rRNA为靶基因设计分枝杆菌通用引物进行扩增的基础上，结合应用结核杆菌特异性引物(IS6110) 进行多重PCR反应，PCR产物再与13种特异探针进行反向斑点杂交。Primer pMyc 14bio (5’-GRGRTACTCGAGTGGCGAAC-3’) pMyc7bio (5’- GGCCGGCTACCCGTCGTC-3’）扩增16S rDNA序列。PrimerPt18（5’-gaaccgtgagggcatcgagg- 3’）INS2bio（5’-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3’）扩增结核杆菌IS6110序列。该研究的意义在于某些结核分枝杆菌缺乏IS6110序列时，也能被基于16S rRNA的通用引物扩增，从而降低了假阴性率的发生，该研究的局限性在于目前所知分枝杆菌的种特异性探针数量有限，只能同时检测13种分枝杆菌，而且在海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌以及堪萨斯和胃分枝杆菌之间存在探针重叠，因而无法鉴别。
与痰培养比较，PCR加核酸杂交法的敏感性为91.9%/79.4%；特异性为99.8%/99.6%[10]。在涂片阴性的标本中敏感性更低。基于PCR的诊断技术存在两个主要问题：假阳性反应，多因污染了原来扩增反应的DNA片段；假阴性反应，由于存在干预PCR反应的抑制剂等。目前用于防止假阳性反应的措施为以尿嘧啶－N－糖基化酶和dUTP 代替dTTP加入反应体系。使用硫氰酸胍和硅藻可以有效去除PCR反应抑制剂[12,13]。
二、分离菌株的菌种鉴定
传统的分枝杆菌菌种鉴定基于一系列生化学试验和显型反应。生化试验的缺点是耗时长，步骤繁复，而且可能产生模棱两可的结果，因此目前越来越倾向于使用分子手段做种间鉴定。
1. DNA Probe：对于临床常见致病分枝杆菌，已有现成可以获得的DNA探针，包括结核分枝杆菌复合群、鸟、胞内、堪萨斯、戈登等分枝杆菌。探针经吖啶酯标记，结果经荧光光度计测定，实验周期仅2 h，方法简便易行。缺陷已如前述：不是所有分枝杆菌都有已知的特异探针，结核杆菌复合群的探针不能区分人型，牛型及BCG等。
2. PCR－直接测序法：这种方法的基本过程是，先PCR扩增一模板DNA，然后对扩增片段进行测序。测序后或人工解读或使用数据分析软件自动解读。基于PCR的测序已成为分枝杆菌菌种鉴定的金标准，甚至有人将此技术用于直接检测标本中的分枝杆菌，尤其对于传统培养不能生长的菌种[14,15]。常用的靶基因有：16S-rRNA基因，是非常理想的基因分类靶基因有如下优点：①其分子结构具有高度保守的特性，只在某些位置有少量的核苷酸序列改变，而这些位置的改变有分枝杆菌属或种特异性。②许多分枝杆菌的16S-rRNA基因序列已测定完成。③长度适中，基因在细胞内有多拷贝。针对该基因两个高度可变区进行测序可以鉴定大部分分枝杆菌菌种，但不能区别结核杆菌复合群，堪萨斯与非致病性胃分枝杆菌在此两个区域序列相同，在区分海及溃疡分枝杆菌时需另外测定16S-rRNA基因的其他序列[16,17]。Kirschner等[16]于1993年就利用这一方法实现了对52种分枝杆菌的菌种鉴定。另外32-kDa蛋白[18]，65-kDa热休克蛋白[19]和16S-23S rRNA区间序列包含足够的序列多样性，可以区分所有临床上重要的分枝杆菌，也可鉴别堪萨斯和胃分枝杆菌。
