细胞凋亡与流式细胞术

一、概念

    细胞凋亡（apoptosis），又称程序性细胞死亡（programmed  cell  death），是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序性的死亡。
    与细胞的坏死不同，细胞凋亡不是一种被动的过程，而是一种主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用。它并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是更好地适应生存环境而主动采取的一种死亡过程。
    发生凋亡的细胞，细胞膜发生皱缩、凹陷，染色质变得致密，最后断裂成小碎片。进一步发展，细胞膜将细胞质分割包围，有些包围了染色质的断片，形成了多个膜结构尚完整的泡状小体，成为凋亡小体（apoptotic  body）。其特点是具有完整的膜状结构，胞膜表面微绒毛消失，内容除了胞质以外，还有降解的染色质断片。
1972年，Kerr、Wyllie及Gurrie等发表了程序性细胞死亡研究中具有里程碑意义的论文，首次提出了程序性细胞死亡和细胞凋亡的概念，宣告了对细胞凋亡真正探索的开始。

表1 细胞凋亡与细胞坏死的比较

                              细胞凋亡                坏死

    形态学                细胞皱缩、片段化          溶解
    膜的完整性            保持                      不能保持
    线粒体                自身吞噬或不受影响        肿胀、Ca2+内吞
    染色质                致密                      分解
    自吞噬                常见                      缺少
    潜伏期                数小时                    没有
    蛋白质合成            有                        无
    始发因素              胚胎、变态发育            毒素、缺血、酸碱度
    典型细胞              胚胎神经元                肝细胞+毒素
    控制因素              内分泌                    毒素
    胞质生化改变          溶酶体酶增多              溶酶体解体
    核生化改变            DNA片段化                弥漫性降解
    最初表现              蛋白质合成下降            肿胀

二、细胞凋亡的几个研究阶段

（一） 形态学特征
    凋亡小体的形成

    染色质DNA的降解
    1、早期由于内源性核酸内切酶基因的活化和表达而造成的结果。
    2、染色质DNA的断片是有规律的，进行琼脂糖电泳时，可见ladder  现象。
    3、染色质DNA的断裂，大多为单链断裂。
    4、染色质DNA断裂的位置，大部分在核小体之间的连接位置。
    5、凋亡小体形成。

（二） 生物化学阶段
    RNA/蛋白质大分子的合成
    钙离子
    内源性核酸内切酶

（三） 分子生物学阶段
    与细胞凋亡有关的基因

（四） 临床应用基础研究阶段
    1、 APO--1/Fas的插入失活是自身免疫性疾病的重要发病机制。
    2、导入APO--1/Fas基因表达是设计特定细胞细胞自杀机制的重要手段之一。
    3、导入生存基因表达防止细胞凋亡也是细胞凋亡机制的重要作用之一。
    神经生长因子（NGF）基因的克隆化成功，NGFβ的转基因表达技术的不断成熟，为某些中枢及外周神经系统疾病的治疗，提供了一个重要条件。

三、 细胞凋亡与免疫学的关系

（一）胸腺细胞成熟过程中细胞凋亡
1、 阳性选择和阴性选择，以形成CD4+的T淋巴细胞亚型和CD8+的T淋巴细胞亚型。
2、 对识别自身抗原的T淋巴细胞克隆进行选择性消除，其细胞克隆的死亡机制主要是通过细胞凋亡，从而形成免疫耐受。

（二）激活诱导的细胞凋亡
    AICD是T淋巴细胞的程序性死亡的又一种主要类型，主要控制激活T细胞的寿命。T淋巴细胞受到刺激以后就开始活化，活化以后的T淋巴细胞如果有生长因子的存在，即发生增殖反应，如果没有或较少的生长因子存在，则发生AICD。

（三）激活淋巴细胞对靶细胞的攻击
    淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK  cell）以细胞凋亡的机制杀伤靶细胞。
四、 细胞凋亡与临床医学的关系
（一）人免疫缺陷病毒感染造成CD4+细胞减少是通过细胞凋亡机制。
（二）从细胞凋亡的角度来看，肿瘤之所以发生不是因为细胞生长过快，而是细胞死亡太慢造成的不平衡结果。
（三）细胞凋亡的研究将给自身免疫性疾病带来真正的突破。
五、 流式细胞术检测细胞凋亡
1、凋亡DNA的检测
    凋亡细胞的重要特点就是染色体基因组DNA的片段化。凋亡细胞的细胞膜通透性增加，小分子DNA的片段丢失，以DNA特异性荧光染料染色后，染色度下降。用流式细胞仪分析，表现为DNA着色度低于G0期的细胞，即在细胞周期中出现亚二倍体峰，也叫凋亡峰。
2、细胞质膜的完整性
    培养的细胞首先以碘化丙啶PI处理，之后再以HO33342处理，就可以区别出坏死细胞及凋亡细胞。因为两种荧光染料可使不同死亡类型的细胞呈现不同的荧光类型。坏死细胞用PI染色以后发出的红色荧光高于凋亡细胞，但以HO33342染色后所发出的蓝色荧光却恰恰相反，以资区别。
3、线粒体跨膜电位
    线粒体能够维持其跨膜电位的能力可以通过阳离子探针滞留，即罗丹明123（rhodamine  123）的滞留来检测，可以区别坏死与凋亡细胞。
4、溶酶体质子泵
    以AO进行染色，这种染料在浓度较低（1~5μmol/L）时对活细胞有较强的染色，其红色荧光的亮度也是反映溶酶体质子泵功能的一个重要参数。
凋亡细胞溶酶体结构基本完整，因而可使AO染料进行累积，也就是说在凋亡细胞中，ATP依赖的质子泵并未发生明显的变化。但坏死细胞失去了溶酶体的完整结构，也失去了积累AO的能力，因而其红色荧光很低，以资区别。
5、蛋白质和DNA含量
    均下降
6、光的散射
    开始，FSC下降明显；后来，FSC和SSC均下降。坏死细胞，两者显著下降。
7、DNA的原位降解
    AO对双链DNA和变性的DNA的染色不同。与双链DNA结合，荧光呈绿色；与片段化的DNA结合，则变为红色荧光。因此，红色荧光在总荧光强度中所占比例，即代表了细胞中DNA的降解程度。
红色荧光/绿色荧光
8、细胞凋亡的定量测定
    ⑴单细胞悬液的制备
    ⑵T细胞的激活
    ⑶细胞的荧光染色
    HO33342、抗CD4或抗CD8单抗
六、  几种用流式细胞术检测细胞凋亡的方法及试剂简介
(一) 诱导细胞凋亡
    正常组织细胞在各种细胞毒性刺激因子的诱导下，可发生细胞凋亡。这些刺激因子
可以是活化的细胞表面受体，诸如  Fas、TNFR1或TCR；也可以是生长因子的减退、紫外线的照射、糖皮质激素或钙离子治疗等。各种在体外诱导细胞凋亡，进而进行凋亡研究的方法已经广泛地应用于免疫、细胞生物、神经学和基因学等各个学科领域之中。
    下面介绍两种诱导细胞凋亡的方法：
1、 Fas和FasL
    Fas（CD95），表达于各种正常细胞或肿瘤细胞的表面，可介导细胞凋亡。FasL，即Fas配基，表达于活化的T细胞、NK细胞、单核细胞和中性粒细胞。FasL通过与Fas的结合，介导活化T淋巴细胞与NK细胞对Fas+靶细胞的溶解作用。在特定的环境下，FasL还可以保护组织免于炎症因子的损坏。在肿瘤的病理变化过程中，Fas-FasL系统可抑制抗肿瘤的细胞免疫，高表达FasL，从而逃逸免疫监视。几种细胞株可在抗Fas的抗体诱导下产生凋亡。
    [附实验方法]
    Induction  of  Apoptosis  using  Anti-Human  Fas(CD95)  Monoclona  Antibody 
    ⅠMaterials  Required
    ⑴  A  cell  line  or  primary  cells  that  can  easily  be  induced  to  undergo  apoptosis  by  human  Fas  mAb.  Examples  include  Daudi  human  lymphoma  cells  (ATCC  CCL  213)  or  Jurkat  T  cells  (ATCC  TIB  152).
    ⑵Anti-human  Fas  mAb,Clone  DX2(Cat.No.33450D).*
    ⑶Recombinant  Protein  G  (SIGMA,Cat,  No.P4689).We  have  found  that  the  addition  of    Protein  G  to  the  tissue  culture  medium  can  significantly  enhance  the  efficiency  of  DX2  mAb  to  induce  apoptosis.
    ⑷T25  tissue  culture  flasks.
    ⑸IMDM  or  RPMI-1640  medium  supplemented  with  10%  heatinactivated  fetal  bovine  serum(FBS),1%L-glutamine  and  1%antibiotics  (penicillin  /streptomycin;    100  U/ml).This  supplemented  medium  is  referred  to  as  ''medium''  below.
    ⅡProcedure
    ⑴Maintain  the  cells  in  culture  and  change  the  medium  one  day  before  inducing  apoptosis.
    ⑵Induction  of  apoptosis:  Add  0.5-2ug/ml  DX2  mAb  (Cat.  No.33450D)  and  1-2ug/ml  Protein  G  to  a  T25  flask  with  medium  containing  ~0.5x106  cells/ml.  Negative  controls  should  consist  of  (1)~  0.5x106  cells/ml  with  medium  alone  (no  mAb  or  Protein  G),  and  (2)~    0.5x106  cells/ml  with  medium  and  1ug/ml  Protein  G  alone  (no  mAb).
    ⑶Incubate  the  cells  for  2-12  hr  at  37℃.
    ⑷Proceed  with  assays  designed  to  evaluate  induction  of  apoptosis.
2、喜树碱
    喜树碱是一种有效的拓扑异构酶抑制剂，而后者是DNA合成所必需的分子。实验已经证明，喜树碱可在体外诱导细胞凋亡的发生。

来源：四川迈克医疗设备工程技术有限公司学术应用部