凋亡在脐血造血干/ 祖细胞冷冻损伤中的作用及其机制研究
肖娟,邹萍,黄士昂,胡中波,刘凌波,游泳华 中国实验血液学杂志
摘要 为探讨脐血造血干/ 祖细胞冷冻损伤中凋亡的作用及其机制,应用流式细胞术检测脐血CD34 + 细胞冻存前后细胞凋亡率、线粒体膜势能和Fas 抗原,用免疫组织化学法检测Bcl22 蛋白表达,用Western blot 和caspase23 蛋白活性分析检测caspase23 的表达,以甲基纤维素半固体培养进行造血祖细胞集落分析。研究结果显示,CD34 + 细胞在- 196 ℃冻存2 周或4 周后凋亡率增加,电泳出现DNA 梯形条带,CFUs 分别下降了25. 2 %和30. 1 %。冷冻过程中细胞内线粒体膜势能下降,Bcl22 蛋白表达下调,而Fas 抗原表达无明显改变。新鲜分离的CD34 + 细胞中caspase23以分子量为32 kD 的非活性酶原形式存在,冷冻过程中caspase23 被激活,可检测到分子量为20 kD 的裂解片段,cas2pase23 蛋白活性分别增加了1. 2 倍和1. 5 倍。结论:凋亡在脐血造血干细胞冷冻损伤中起着重要作用,其机制可能是通过线粒体介导的caspase 依赖性途径执行,caspase23 是其中一个重要的效应蛋白酶。
关键词 细胞凋亡; 脐血; 造血干/ 祖细胞; CD34 + 细胞; 冷冻保存; Caspase23
中图分类号 R331. 1 ; R733. 1 文献标识码 A
Role of Apoptosis in Cryoinjury of Cord Blood Hematopoietic Stem/Progenitor Cells and Its MechanismXIAO Juan , ZOU Ping , HUANG Shi2Ang , HU Zhong2Bo , LIU Ling2Bo , YOU YongInstitute of Hematology , Union Hospital Affiliated toTongji Medical College , Huazhong University of Science and Technology , Wuhan 430022 ,ChinaAbstract To investigate the role and mechanism of apoptosis in cryoinjury of cord blood hematopoietic stem/ progenitor cells ,apoptosis of CD34+ cells , mitochondrial membrane potential (MMP) and Fas antigen expression were detected by flow cytometry(FCM) , the Bcl22 protein expression was detected by immunohistochemistry,caspase23 expression was determined by Western blot and caspase23 activity analysis , colony2forming units (CFU) was performed by semi2solid methylcellulose culture. The results showed that when cells were store at - 196 ℃for 2 weeks or 4 weeks , apoptotic cells increased , gel electrophoresis displayed typical DNA ladder , and CFU decreased by 25. 2 % and 30. 1 %. The value of MMP reduced and expression of Bcl22 protein was down2regulatedduring the freeze2thaw process , but the Fas antigen expression was not effected. However , only the 32 kD inactive caspase23 proenzyme was detected in freshly isolated CD34+ cells. After freeze2thaw , caspase23 was activated and a cleavage of 20 kD protein was detected. Cryopreserved cells showed a 1. 22fold and 1. 52fold increase in caspase23 activity , respectively. It is concluded that apoptosis plays an important role in cryoinjury of cord blood hematopoietic stem/ progenitor cells , which triggers a mitochondrial apoptotic pathway that is caspase2dependent but does not require death receptors , where caspase23 is the key effector.
Key words apoptosis ; cord blood ; hematopoietic stem/ progenitor cell ; CD34+ cells ; cryopreservation ; Caspase23
J Exp Hematol 2004; 12 (1) :90 - 94
脐血因其独特的生物学特性、资源优势及临床移植适应证广泛已成为造血干细胞移植(HSCT) 的细胞来源之一。随着脐血库的大量建立,如何有效地低温保存脐血干细胞一直是人们关注的热点。近年来研究表明,造血干细胞在冻存2复苏(冻融) 过程中不可避免地发生了凋亡事件,造血干细胞凋亡严重损害其克隆形成能力和移植后的造血重建功能[1 ,2 ] 。尽管造血干细胞复苏后在体外经适当生长因子扩增,可恢复造血潜能,但限制了其在临床上的实际应用。随着对低温冻存理论的深入认识,人们发现凋亡参与了细胞冷冻损伤的分子机制,caspase 抑制剂能改善多种细胞冻存后的生存率[3 - 5 ] 。然而,凋亡在脐血造血干细胞冷冻损伤中的作用及机制目前仍不清楚,本研究试图对此进行初步探讨。
材料与方法
标本来源及CD34 + 细胞的分选
脐血标本由华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科提供。收集足月正常分娩的胎儿脐带血50- 100 ml , Ficoll2Paque 淋巴细胞分离液分离单个核细胞。用CD34 + 细胞免疫磁珠分离系统(MACS ,Miltenyi Biotec 公司) 分选CD34 + 细胞,具体方法参见试剂盒说明。流式细胞仪分析CD34 + 细胞的纯度达94. 6 % ,台盼蓝拒染法显示细胞活力为94 % -98 %。
CD34 + 细胞的冻存与复苏
上述分离纯化的CD34 + 细胞用冻存液( 含70 %IMDM、20 %胎牛血清和10 % DMSO) 配制成1 ×105/ml 细胞悬液,按下列程序进行液氮保存:4 ℃,15 分钟; - 20 ℃,2 小时; - 80 ℃,过夜;最后投入- 196 ℃冷冻。细胞在- 196 ℃冻存2 周或4 周之后,立即放入40 ℃水浴箱中,在2 分钟内融化完毕,用IMDM洗涤备用。
细胞凋亡检测
Annexin V 法 用annexin V 凋亡检测试剂盒(Clon2tech 公司) 通过流式细胞仪进行测定。1 ×105 细胞与5μl annexin V2FITC 和10μl 碘化丙锭(PI) 室温避光孵育15 分钟,加400μl 结合缓冲液上机,测定细胞凋亡率。
DNA Ladder 收集细胞,常规蛋白酶K法提取基因组DNA ,按ApoAlertTMLM2PCR Ladder Assay Kit (Clon2tech 公司) 说明书进行操作,反应产物行15 g/ L 琼脂糖凝胶电泳。
造血祖细胞集落分析
培养基为商品化的甲基纤维素培养基MethoCultTMGF+ H4435 (Stem cell 公司) 。接种新鲜分离或不同冻存条件下复苏的CD34 + 细胞1 ×104/ ml 于24 孔板中,每孔1 ml ,复种3 孔,37 ℃、5 % CO2 的饱和湿度培养箱中培养14 天,计数CFU2GM和BFU2E。细胞内线粒体膜势能( mitochondrial membrane po2tential , MMP) 检测按ApoAlertTM Mitochondrial Membrane Sensor Kit (Clon2tech 公司) 说明书进行操作。收集细胞,1 000 rpm 离心5 分钟,加入5μg/ ml 的MitoSensor ,37 ℃孵育15 -20 分钟,孵育缓冲液洗涤后,上流式细胞仪检测。
细胞表面Fas 抗原表达调整CD34 + 细胞数为1 ×105/ ml ,加入PE2CD95 抗体20μl ,4 ℃避光孵育30 分钟,流式细胞仪检测不同组别细胞表面Fas 抗原的表达。
Bcl22 蛋白表达的检测
细胞离心涂片,4 %多聚甲醛固定,5 %正常山羊血清室温孵育20 分钟,加入鼠抗人Bcl22 单克隆抗体(Santa Cruz 公司) 或非特异性对照,4 ℃过夜。滴加生物素化二抗,37 ℃反应30 分钟,PBS 洗3 次,每次5 分钟。然后加入ABC2碱性磷酸酶反应试剂4 ℃1小时。脱水,透明,封片。光镜下观察阳性细胞,计算其百分率。
Caspase23 蛋白检测
Western2blot 从细胞中分离提纯蛋白质,电泳,转膜,进行免疫印迹显色。首先配制封闭液(含1 %脱脂奶粉和0. 05 % NaN3) 封闭硝酸纤维素滤膜,然后将硝酸纤维素滤膜与抗人caspase23 抗体(Santa Cruz公司) 置37 ℃水浴摇床温育2 小时(caspase23 抗体为全长型单克隆抗体,既能结合酶原形式的caspase23 ,也能结合caspase23 的裂解产物) ,再与碱性磷酸酶标记的二抗置37 ℃水浴摇床温育1 小时(所用抗体用TBS2Tween 稀释液以1∶1 000稀释备用) 。制备底物溶液,将硝酸纤维素滤膜转移入一新袋,加入底物置室温温育,直至在蛋白条带处形成紫色沉淀为止,用20 mmol/ L Tris/ HCl (pH 8. 0) ,5 mmol/ L EDTA 替换底物溶液,终止反应。
Caspase23 蛋白活性测定 按ApoAlertTM Caspase23Colorimetric Assay 试剂盒(Clontech 公司) 说明进行操作:收集并裂解细胞,冰上孵育10 分钟,10 000 r/min 4 ℃离心5 分钟,取上清,分别加入反应缓冲液/DTT 混合物及caspase23 底物(DEVD2pNA) ,37 ℃水浴1 小时。选择405 nm 波长,比色法分析caspase23 蛋白活性。
统计学分析
应用STATA 5. 0 统计分析软件进行检验。实验结果以均数±标准差( ?x ±s) 表示,均数间差异采用方差分析和t 检验。P < 0. 05 认为有统计学意义。
结 果
冻存前后细胞凋亡率和克隆形成能力
对脐血CD34 + 细胞冻存前后细胞凋亡率和克隆形成能力的检测结果见表1。新鲜分离的CD34 + 细胞凋亡率很低, 冻融后凋亡细胞明显增多( P <0101) 。DNA Ladder 检测证实凋亡细胞出现DNA 断裂片段,电泳显示出梯形条带(图1) 。集落培养显示,冻融过程损害了造血干细胞的克隆形成能力,- 196 ℃冻存2 周和4 周后总CFUs (包括CFU2GM和BFU2E) 分别下降了25. 2 %和30. 1 %。
Table 1. The apoptosis and CFUs of cord blood CD34+ cells（略）
3 P < 0. 01 , # P < 0. 05 , compared with fresh isolated cells. n = 25（略）
Figure 1. DNA fragment electrophoretogram of cord blood CD34 + cells before and after cryopreservation. M: 100 bpDNA Ladder marker. Lane 1 : fresh isolated CD34+ cells.Lane 2 : CD34+ cells stored at - 196 ℃for 2 weeks. Lane 3 :CD34 + cells stored at - 196 ℃for 4 weeks
线粒体膜势能(MMP) 检测
荧光染料MitoSensor 可进入正常细胞的线粒体,形成聚合体,发红色荧光( FL21 象限) ; 细胞凋亡时,MMP 降低,MitoSensor 不能进入线粒体,在胞浆中仍然保持单体形式,发绿色荧光(FL22 象限) 。流式细胞仪检测发现,冻存细胞内线粒体MMP 明显下降,结果见表2。
Table 2. MMP of cord blood CD34+ cells before and after cry2 opreservation ( FCM)（略）
3 P < 0. 01 , compared with fresh isolated cells. n = 25
脐血CD34 + 细胞冻存前后Fas 抗原和Bcl22 蛋白的表达新鲜分离的CD34 + 细胞的表面弱表达Fas 抗原,在- 196 ℃冻存2 周和4 周后Fas 抗原表达无明显增加( P > 0. 05) ,但冻融过程中细胞内Bcl22 蛋白表达明显下调( P < 0. 05) ,结果见表3。
Table 3. The expression of Fas antigen and Bcl22 protein of cord blood CD34+ cells before and after cryopreservationGroup Fas ( %) Bcl22( %)（略）
脐血CD34 + 细胞冻存前后caspase23 检测
Caspase23 是凋亡途径中关键性的效应蛋白酶,其活性裂解产物包括17 - 24 kD 的生物活性片段。结果显示,在新鲜分离的脐血CD34 + 细胞中,检测到的是分子量为32 kD 的非活性酶原形式的caspase23 蛋白;在- 196 ℃冻存2 周和4 周后均可检测到分子量为20 kD 的caspase23 蛋白活性裂解片段(图2) 。而且,caspase23 蛋白活性在细胞冻融过程中明显升高,与新鲜分离的脐血CD34 + 细胞相比,在- 196 ℃冻存2 周和4 周后细胞内caspase23 蛋白活性分别增加了1. 2 倍和1. 5 倍。
讨 论
近年来低温冻存技术已取得很大进展,如使用程序降温仪控制冻存温度,改良冷冻保护剂,或在冻存液中加入膜稳定剂和生物抗氧化剂,均能显著改善细
（略）
Figure 2. Expression of caspase23 of cord blood CD34+ cellsbefore and after cryopreservation by Western blotting analysis.
Lane 1 : fresh isolated CD34+ cells. Lane 2 : CD34+ cells stored at - 196 ℃for 2 weeks. Lane 3 : CD34+ cells stored at
- 196 ℃for 4 weeks
胞回收率[6 ,7 ] 。尽管如此,复苏后24 小时以内仍有相当比例的冻存细胞发生死亡。研究发现,细胞冷冻过程中在外界因素的作用下,如氧化应激反应、渗透性损伤、Na + / K+2ATP 酶抑制导致离子内环境紊乱等,均可发生凋亡,且凋亡参与了细胞冷冻损伤的分子机制[3 ,8 ] 。对脐血CD34 + 细胞在冻融过程中的生物学行为研究结果显示,冻存细胞的凋亡率明显增加,细胞内出现DNA 断裂片段,其造血克隆形成能力明显下降,提示细胞凋亡在脐血干细胞冷冻损伤中起着重要作用。
细胞凋亡是一个复杂的病理生理过程,目前明确的介导细胞凋亡的途径有两条:细胞外途径和细胞内途径。细胞外途径即细胞膜死亡受体(如Fas ,TNFR ,TRAIL) 与配体结合后启动FADD 途径,由cas2pase28 介导下游信号传导。细胞内途径即在各种应激反应下线粒体跨膜势能下降,细胞色素C 释放,由caspase29 介导下游信号传导。这两条途径均激活caspase 级联反应, 导致细胞发生凋亡[9 ,10 ] 。那么,脐血冻融过程中如何启动细胞的凋亡呢? Fas是典型的死亡受体,本研究观察到CD34 + 细胞冻存前后其Fas 抗原表达并无明显改变,但细胞在冻融过程中线粒体跨膜电位明显下降。已知Bcl22 家族在线粒体膜电位改变介导的凋亡途径中起重要的调节作用,Bcl22 蛋白能提高线粒体膜的稳定性,直接或间接阻止细胞色素C 释放,具有抗凋亡作用。我们发现细胞冻存后Bcl22 蛋白表达明显下调,与凋亡程度相一致。因此,推测细胞在冻融过程中发生的凋亡是通过线粒体介导的,依赖caspase 途径执行,而不依赖死亡受体途径。这与Stroh 等[4 ]的报告一致:转染Bcl22 蛋白的Jurkat 细胞能抵抗冻融过程中的凋亡发生,而阻断死亡受体信号传导,如应用中和性抗Fas 抗体,转染c2FLIP 蛋白(一种caspase28 抑制剂) ,并不能对冷冻损伤导致的凋亡产生保护效应。caspase23/ CPP32 是凋亡级联反应关键性的酶之一,活化的caspase23 可切割ADP 多聚核糖核酸酶(PARP) 、肌动蛋白(actin) 、核纤层蛋白(lamins) 、凝溶胶蛋白(gelsolin) 等下游底物。正常情况下,胞浆中caspase23 以无活性的分子量约为32 kD 的caspase23酶原形式存在,只有当细胞发生凋亡时才变为有活性的caspase23。此时细胞可存在形态学变化,如染质凝集,DNA 片段形成,凋亡小体出现[11 ] 。本研究发现,在细胞冻融过程中caspase23 被激活,可检测到分子量为20 kD 的活性裂解片段,同时细胞内caspase23 蛋白酶活性明显升高。提示caspase23 在血CD34 + 细胞的冷冻损伤中是一个重要的效应蛋白酶。
脐血移植有逐渐代替骨髓移植的趋势,然而1份脐血的细胞数量有限,提高脐血干细胞冻存后的回收率和克隆形成能力具有重要的临床意义。对脐血干细胞在冷冻损伤中的凋亡事件进行探讨,可为脐血库监测冻存脐血细胞质量和改善低温冻存体系提供参考标准。
参考文献
1 de Boer F , Drager AM, Pinedo HM, et al . Early apoptosis largely accounts for functional impairment of CD34 + cells in frozen2thawed stem cell grafts. J Hematother Stem Cell Res , 2002 ; 11 : 951 - 963
2 Schuurhuis GJ , Muijen MM, Oberink JW, et al . Large populations of non2clonogenic early apoptotic CD342positive cells are present in frozenthawed peripheral blood stem cell transplants. Bone Marrow Transplant ,2001 ; 27 : 487 - 498
3 Baust JM, Vogel MJ , Van Buskirk R , et al . A molecular basis of cryopreservation failure and its modulation to improve cell survival . Cell Transplant , 2001 ; 10 : 561 - 571
4 Stroh C , Cassens U , Samraj AK, et al . The role of caspases in cryoinjury : caspase inhibition strongly improves the recovery of cryo2 preserved hematopoietic and other cells. FASEB J , 2002 ; 16 : 1651 - 1653
5 Peter AT , Linde2Forsberg C. Efficacy of the anticaspase agent zVAD2fmk on post2thaw viability of canine spermatozoa. Therio2 genology , 2003 ;59 :1525 - 1532
6 Eroglu A , Russo MJ , Bieganski R , et al . Intracellular trehalose im2proves the survival of cryopreserved mammalian cells. Nat Biotechnol ,2000 ; 18 : 163 - 167
7 Limaye L S , Kale V P. Cryopreservation of human hematopoietic cells with membrane stabilizers and bioantioxidants as additives in the conventional freezing medium. J Hematother Stem Cell Res , 2001 ; 10 : 709 -718
8 Rauen U , Polzar B , Stephan H , et al . Cold2induced apoptosis in cultured hepatocytes and liver endothelial cells : mediation by reactive oxygen species. FASEB J , 1999 ; 13 : 155 - 168
9 Schulze2Osthoff K, Ferrari D , Los M, et al . Apoptosis signaling by death receptors. Eur J Biochem, 1998 ; 254 :439 - 459
10 Fleury C , Mignotte B , Vayssiere JL. Mitochondrial reactive oxygen species in cell death signaling. Biochimie , 2002 ; 84 : 131 - 141
11 Porter AG, Janicke RU. Emerging roles of caspase23 in apoptosis. Cell Death Differ , 1999 ; 6 : 99 - 104
中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所,武汉430022
