人脐血CD133 + 细胞体外短期培养中生物学特性的变化
郝思国,孙关林,邬维礼,吴英理 中国实验血液学杂志
摘要为了解脐血CD133 + 细胞的生物学特性及其在体外短期扩增培养中的变化,探讨其体外扩增的可行性,初步观察了脐血CD133 + 细胞的免疫表型、细胞周期、端粒酶活性以及粘附分子的表达等生物学特性及其在体外扩增中的动态变化并与CD34 + 细胞进行比较。结果显示,新鲜脐血CD133 + 和CD34 + 细胞的含量分别为(1. 05 ±0173) %和(1. 40 ±0. 56) % ,CD34 + 细胞中79. 62 %为CD133 + CD34 + 细胞,而CD133 + 细胞中97 %以上为CD133 +CD34 + 细胞。短期扩增培养结果显示,CD133 + 细胞组扩增第10 天,CD133 + , CD133 + CD34 + 和CD34 + CD38 - 细胞以及第6 天的CFU2mix , HPP2CFC 和CD34 + CD38 - 细胞的扩增倍数要高于CD34 + 细胞组( P < 0. 05) ;扩增中,CD133 + CD34 + 细胞的比例逐渐下降,而CD133 - CD34 + 和CD133 - CD34 - 细胞的比例则逐渐上升。新鲜脐血CD133 + 和CD34 + 细胞的端粒酶活性较低,但高于CD34 - 细胞。扩增1 周后,端粒酶活性明显上调,15 天以后又逐渐下降;90 %以上脐血CD133 + 细胞表达CD11a , CD49d 和CD54 ,约50 %表达CD62L 。扩增早期,CD49d 表达上调,CD11a 表达无明显变化,而CD54 和CD62L 则有下调趋势,随着扩增时间的延长,各种粘附分子的表达均有不同程度的下调。在整个扩增过程中,大部分CD34 + 细胞仍然表达CD11a , CD49d 和CD54。结论:CD133 可能是较CD34 更为原始的造血干/ 祖细胞的表面标志,CD133 + 细胞具有更强的扩增潜能。粘附分子的下调、端粒酶活性的下降可能是扩增产物早期植入延迟的原因之一。
关键词 脐血; CD133 + 细胞; 生物学特性; 体外扩增
中图分类号 R329128 ; R33111 ; R33112 文献标识码 A
Studies on the Dynamics of Biological Characteristics of CD133 + Cells from Human Umbil ical Cord Blood during Short2term Culture HAO Si2Guo , SUN Guan2Lin , WU Wei2Li , WU Ying2Li Stem Cell L aboratory , S hanghai Instit ute of Hematolgy , Ruiji n Hospital , S hanghai Second Medical University , S hanghai 200025 ,Chi naAbstract This study was to investigate dynamics of biological properties of CD133 + cells from human umbilical cordblood (UCB) during short2term culture containing the combination of hematopoietic growth factors and the feasibility ofin vit ro expansion of CD133 + cells. The biology activities including analysis of cell cycle , immunophenotype , telomeraseactivity, expression of adhesion molecules and expansion potential of CD133 + cells were monitored during ex2vivoexpansion , and compared with those of CD34 + cells. The results showed that the contents of CD133+ and CD34 + cells infresh UCB were (1. 05 ±0. 73) % and (1. 40 ±0. 56) % respectively. About 79. 62 % of CD34+ cells expressed CD133 ,and more than 97 % of CD133+ cells were CD133 + CD34 + , markedly higher than that in CD34+ fraction ( P < 0. 01) .No significant differences were observed in content of cells expressing CD38 , CD13 , CD14 , CD61 and glycophorin2Abetween the two fractions. Expansion of CD133 + , CD133 + CD34 + and CD34 + CD38 - cells at 10 days and those of CFU2mix , HPP2CFC and CD34 + CD38 - cells at 6 days from CD133 + cells group were significantly higher than those from theCD34 + cell group ( P < 0. 05) . Analysis of immunophenotype showed that CD133+ CD34 + cells declined gradually whileCD133 - CD34 + and CD133 - CD34 - cells increased during ex2vivo expansion ; basal telomerase activities of fresh UCBCD133 + and CD34 + cells were low but significantly exceeded that of CD34- fraction ( P < 0. 05) . At first week ofexpansion , telomerase activity was significantly upregulated , after two weeks , telomerase activity remarkably declined ,and decreased to baseline or below the limits of detection in day 20. More than 90 %of CD133+ cells expressed CD49d andCD11a , and , more than 85 % of the cells expressed CD54 , about 50 % of cells expressed CD62L. At the early stage ofexpansion , expression of CD49d was upregulated , expression of CD11a remaining no change , while as expression of CD54and CD62L was downregulated. Expression of all adhesion molecules was decreased gradually with extend of culture. Butexpression of these adhesion molecules on CD34+ subsets were not affected significantly during expansion. It is concludedthat CD133 + population may be a more primitive hematopoietic stem/ progenitor cells ( HSPC) than CD34 + cells , CD133 + cells have great expansion potential for ex2vivo expansion and is a suitable target cell for ex2vivo expansion ofHSPC. Downregulation of adhesion molecules and telomerase activity may be one of the reasons for delayed engraftment ofexpanded products.
Key words umbilical cord blood ; CD133+ cell ; biological property ; ex2vivo expansion
J Ex p Hematol 2003 ; 11 (6) :569 - 575
在过去的十几年里,CD34 + 细胞一直被作为造血干/祖细胞(HSPC) 扩增以及其基础研究的靶细胞。然而,近年来的研究显示,在哺乳类动物及人类均存在CD34 - 的HSPC ,可以在受体内重建造血,并可分化为CD34 + 细胞,提示这类细胞可能较CD34 + 细胞更为原始[1 - 4 ] ,因此,很有必要去寻找CD34 以外的新的特异性更强并能代表更为早期的HSPC 的表面标志。上世纪末,一个新的HSPC 表面标志AC133 引起了人们的关注,在2000 年6 月英国Harrogate 召开的第7 届人类白细胞分化抗原大会上正式命名为CD133 , 但其功能尚未完全明了。为了探讨CD133 + 细胞的生物学特性以及体外扩增的可行性,我们对人脐血中CD133 + 细胞的生物学特性及其在体外短期扩增培养中的动态变化进行了初步观察,并与CD34 + 细胞进行了比较。
材料与方法
标本来源和细胞制备[5 ]
经知情同意后,无菌采集健康足月产新生儿脐血,常规检测容量、CD34 + 和CD133 + 细胞的含量。应用Ficoll 淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,去除单核细胞后做干细胞分选。
CD34 + 和CD133 + 细胞的分离[ 5]应用MiniMACS 免疫磁珠激活分选系统(MiltenyiBiotech 公司) ,分选CD133 + 细胞。对其中的6 份脐血平均分为两份,分别用于CD133 + 和CD34 + 细胞的分选。对纯化的细胞分别进行纯度、免疫表型、细胞周期、端粒酶活性以及集落培养等检测。细胞纯度> 95 % ,活力> 96 %。
造血生长因子( HGF)
SCF , IL23 , IL26 , TPO 和Flt23 ligand ( Pepero Tech公司) ,G2CSF 和EPO( Kirin 公司) 。体外扩增培养[5 ](2 - 4) ×104 纯化的CD34 + 和CD133 + 细胞分别接种于1 ml 无血清培养液StemSpan H2000 (StemCellTechnologies) 中,其中含有50 ng/ ml 的SCF , IL26 TPO 及Flt23 ligand , 20 ng/ ml 的IL23 和G2CSF 以及2 U/ ml 的EPO ,细胞培养于24 孔培养板,置于5 % CO2 ,37 ℃饱和湿度的培养箱中,4 - 5 天半量换液1 次,对换出的细胞分别进行有核细胞计数、集落培养,应用流式细胞术进行细胞周期、免疫表型和粘
分子表达的分析以及应用PCR2EL ISA 进行端粒酶活性的检测。
造血祖细胞集落培养[1 ]
方法略加修改,1 ×104 纯化的CD34 + 和CD133 + 细胞和不同扩增时期的有核细胞分别接种于0. 5 ml1 %甲基纤维素培养基H4435 ( StemCell) 。细胞培养于24 孔培养板,每组设3 复孔。细胞置于5 %CO2 ,37 ℃饱和湿度的培养箱中,第14 - 21 天计数CFU2GM , BFU2E 和CFU2Mix ,第28 天计数HPP2CFC。
免疫表型分析[2 ]
应用双色荧光流式细胞术分析纯化的CD34 + 和CD133 + 细胞及不同扩增时间有核细胞免疫表型的变化特点, 单抗分别为: 抗2CD342FITC , 抗2CD382PE ,抗2CD142FITC ,抗2CD132PE ,抗2CD612FITC ,抗2Gly2A (血型糖蛋白A , glycophorin A)2PE ,抗2CD32PE、抗2CD192FITC ,同时设立同型IgG 双阴性对照(以上单抗均购自于PharMingen 公司) ,抗CD1332PE(购于Miltenyi Biotech 公司) ,标记细胞用流式细胞仪(Coulter 公司) 分析。
细胞周期的分析
收集纯化的CD34 + 和CD133 + 细胞以及不同扩增时间有核细胞,PBS 洗2 次后,用70 %乙醇固定24 小时以上,检测前PBS 洗1 次,加RNA 酶(终浓度为50μg/ ml) 。37 ℃孵育30 分钟,过滤后加入碘化丙锭进行染色,上机检测10 000个细胞,应用MultiCy2cle 软件分析细胞周期的分布。
端粒酶活性检测
试剂盒购于Roche 公司,按其操作说明进行。简言之,2 ×105 待测细胞,PBS 洗1 次,加200μl 细胞裂解液冰上孵育30 分钟,4 ℃3 000 ×g离心10 分钟,取上清进行端粒重复序列扩增( TRAP) 反应。对PCR 产物应用EL ISA 方法进行定量检测端粒酶活性,取5μl PCR 产物,加20μl 变性液,室温孵育20分钟, 加225 μl 杂交混合液(含地高辛标记的探针) ,充分混匀后加100 μl 混合液于抗生物素包被的微孔板,37 ℃摇床杂交2 小时。加过氧化物酶偶联的抗地高辛抗体100μl ,室温孵育30 分钟。最后加入底物四甲基联苯胺( TMB) 显色10 分钟,加终止液终止反应,测定波长为450 nm 及参考波长为690 nm的吸光值(A) 。端粒酶活性△A = A450- A690 。
应用单抗直接标记双色荧光流式细胞术检测纯化的CD34 + 和CD133 + 细胞以及不同扩增时相有核细胞表面粘附分子VLA4 (CD49d) , ICAM21 (CD54) 以及L2选择蛋白(CD62L) 表达的变化。研究免疫表型的变化特点,所应用的单抗为:抗2CD342FITC ,抗2CD49d2PE , 抗2CD542PE , 以及抗2CD62L2FITC , 同时设立同型IgG 双阴性对照(所有单抗均购自于PharMingen 公司) ,标记细胞用流式细胞仪(Coulter公司) 分析。
统计学处理
结果以?x ±s 表示,组间比较应用Student′s t 检验。
结 果
脐血的一般生物学特性
脐血的容积及其有核细胞,在不同的个体差异较大,13 份脐血的容积范围在60 - 95 ml 。CD34 + 和CD133 + 细胞的细胞纯度分别为(95. 67 ±2. 66) %和(96. 97 ±4. 89) % ,回收率分别为(47. 86 ±21. 49) %和(59. 43 ±17. 23) %。单份脐血可分选得到(1. 46±0. 89) ×106 的CD133 + 细胞。新鲜脐血CD133 +和CD34 + 细胞的含量分别为( 1. 05 ±0. 73) %和(1140 ±0. 56) %。CD34 + 细胞中(79. 62 ±4. 24) %的细胞同时表达CD133 , (16. 26 ±3. 62) %的细胞为CD133 - ,而CD133 + 细胞中,CD34 及CD133 双表达细胞达97 %以上,明显地高于纯化的CD34 + 细胞( P < 0. 01 ) 。两群细胞中其它表型如CD13 ,CD14 ,CD38 ,CD61 以及血型糖蛋白A 的表达无显著差异, > 85 %的细胞表达CD38 , > 90 %的细胞表达CD13 ,而CD14 ,CD61 以及血型糖蛋白A 的表达均比较低( < 5 %) ,见图1 。
扩增潜能的比较
为了探讨应用CD133 + 细胞进行脐血HSPC 体外扩增的可能性,在含有造血生长因子(HGF) 的无血清培养液中对其进行体外扩增观察,并与来自同一份脐血的CD34 + 细胞进行比较。结果,两种细胞均能得到显著地扩增,第10 天,CD133 + 细胞组的有核细胞, CD34 + , CD133 + , CD34 + CD38 - 以及CD34 +CD133 + 细胞分别扩增了235. 66 , 15. 58 , 42. 92 ,91184 和13. 56 倍,其中CD133 + ,CD34 + CD38 - 以及CD34 + CD133 + 细胞的扩增倍数明显地高于相应的CD34 + 细胞组( P < 0. 05) ;第6 天,CD133 + 细胞组的CD34 + CD38 - 细胞,CFU2mix 以及HPP2CFC的扩增倍数也均明显地高于相应的CD34 + 细胞组( P < 0. 05) ,见表1 。
扩增中表面抗原表达的动态变化
对扩增中有核细胞表面抗原表达的动态观察,可以了解扩增细胞的分化情况。为此,对CD133 + 细胞在扩增过程中的CD133 , CD34 , CD38 , CD13 ,CD14 , 以及血型糖蛋白A 的表达进行了动态观察。果显示, 随着扩增时间的延长, 表达CD133 和CD34 细胞的比例逐渐减少,尤以第1 周为显著,1周后趋向缓慢, CD133 抗原表达下降的速度较CD34 抗原表达下降的速度要快( 图2 ) 。同时CD34 + CD133 + 细胞比例逐渐减少而CD133 -CD34 + 和CD133 - CD34 - 细胞比例明显增多(图3) 。其它表面抗原如CD14 ,CD61 和血型糖蛋白A 的表（略）
Figure 1 Immunophenotyping of purif ied umbilical cord blood CD133+ cells
Table 1 Expansion folds of different cell subsets during ex2vivo expansion ( n = 6)（略）
3 P < 0. 05 , compared to purified CD133 + cells（略）
Figure 2 Dynamics of content of CD34+ and CD133 + cells in ex2vivo expansion（略）
Figure 3 Dynamics of content of different cell subsets of CD133+ cell
达逐渐上升。CD3 和CD19 细胞的比例则一直处于很低水平。扩增至第15 天,有核细胞中CD133 + 和CD34 + 细胞的含量仍然可达( 4. 39 ±2. 04) %和(5196 ±2123) % ,明显地高于新鲜脐血中的含量。
细胞周期的变化
细胞周期的变化反映了细胞的增殖状态。结果显示,90 %以上的新鲜纯化的CD133 + 和CD34 + 细胞均处于G0/ G1 期, 但当这些细胞培养于含有HGF（略）
Figure 4 Change of content of cells in different phases of cell cycle
的扩增体系中时,迅速进入增殖循环。扩增1 周,40 %以上的细胞进入S 期。直至第15 天, 仍有30 %以上的有核细胞处于S 期(图4) ,两群细胞之间无明显差异,提示仍有相当数量的细胞具有增殖潜能。
端粒酶活性的动态变化
端粒的长短决定着细胞的寿命和增殖潜能,而端粒的长短则依赖于端粒酶的活性。结果显示,新鲜纯化的脐血CD34 + 和CD133 + 细胞的端粒酶活性△A均数分别为0. 46 和0. 58 ,明显地高于CD34 - 细胞的端粒酶活性(均数△A 为0. 27 , P < 0. 05) ,提示CD34 + 和CD133 + 细胞较CD34 - 细胞具有更强的增殖活性。同时对纯化的CD34 + 和CD133 + 细胞扩增中端粒酶活性的变化进行了动态观察。发现在含有HGF 的扩增体系中,其端粒酶活性迅速上调,扩增的第1 周,端粒酶活性上调了近20 倍。但随着扩增时间的延长其端粒酶活性又逐渐下降,第20 天基本（略）
Figure 5 Dynamics of the tolemersae activity ( △A = A450 -A490
检测不出(图5) ,提示随着扩增时间的延长,细胞逐渐分化和老化而逐渐失去增殖能力。粘附分子表达的变化新鲜纯化的CD133 + 细胞95 %以上表达CD11a 与CD49d 和85 %以上表达CD54 与CD62L 表达率(52. 49 ±5111) %。表达这些粘附分子的细胞同时表达CD34 的比率分别为( 91. 96 ±6. 89 ) % (90144 ±5. 81) % , (82. 77 ±5. 47) %和(47. 73 ±5111) % ,提示扩增前绝大多数的CD34 + 细胞表达CD11a , CD49d 和CD54 。在扩增早期(第6 - 10天) , CD49d 的表达有轻度的上调,CD11a 的表达无显变化,而CD54 和CD62L 的表达则有下降趋势。随着扩增时间的延长,各种粘附分子的表达均有不同程度的下调(图6) 。但在整个扩增过程中,有核细胞中90 %以上CD34 + 细胞仍然表达CD11a 、
（略）
Figure 6 Dynamics of content of cells from CD133+ fractionexpressing cell adhesion molecules
Table 2 Expansion folds of different cell subsets from
（略）其中CD11a + 和CD49d + 细胞扩增较明显,第10 天分别扩增了45. 59 和54. 39 倍,累积扩增分别达91. 18 和108. 78 倍(表2) 。
讨 论
CD34 +细胞一直被认为是骨髓主要的造血活性细胞,能在动物模型中重建造血。尤其是在灵长类动物狒狒中进行富集的CD34 + 细胞移植的成功,更加推动了应用CD34 + 细胞于人类造血干细胞移植中的发展。CD34 已被公认为是骨髓、外周血以及脐血的HSPC 的表面标志,已应用于不同来源HSPC的分选和纯化,体外扩增、移植、转基因,以及自体移植物残留肿瘤细胞的净化等领域[6 - 9 ] 。然而,近年的研究显示,在人和小鼠的骨髓中存在着CD34 - 的原始的HSC , 它不仅可分化为CD34 + 细胞,而且可在体内重建造血并表达多系抗原。有人认为CD34 - 细胞可能是较CD34 + 细胞更为原始的HSC[1 - 3 ] 。因此,对CD34 是否是真正的早期HSC 的标志引起了争议。AC133 被克隆和鉴定后引起了人们的极大关注。有研究者[10 - 11 ] 将CD34 + 细胞分为CD34 + AC133 - 和CD34 + AC133 +两群细胞进行了比较研究,发现CD34 + AC133 + 细胞含有67 %的较原始的CFC ,包括L TC2IC , SCID小鼠再植细胞(SRC) ,HPP2CFC 以及树突状细胞前细胞,而CD34 + AC133 - 仅含有晚期定向祖细胞,主要是红系祖细胞。在植入能力方面, CD34 +AC133 + 细胞的植入能力明显地强于CD34 +AC133 - 细胞。本研究结果显示, 新鲜脐血中CD133 + 细胞约占单个核细胞的1 %。97 %以上的CD133 + 细胞为CD133 + CD34 + 细胞,明显地高于CD34 + 细胞群, CD34 + CD38 - 细胞的比例也高于CD34 + 细胞群。祖细胞集落培养显示,CD133 + 细胞CFU2Mix 及HPP2CFC 的集落形成率要高于CD34 + 细胞。这些结果均提示,CD133 + 细胞可能较CD34 + 细胞更为原始,具有更强的增殖潜能,含有更多的原始的HSPC。
体外扩增是克服单份脐血HSPC 不足的有效方法,已有脐血CD34 + 细胞体外扩增并成功地应用于临床的报告。在以往对CD34 + 细胞体外扩增研究的基础上[5 ] ,对脐血CD133 + 细胞进行了短期体外扩增。结果显示,与CD34 + 细胞相似,在含有HGF的无血清培养体系中,第10 天,CD133 + 细胞的有核细胞总数可扩增200 倍以上。至第15 天,有核细胞中仍含有约5 %的CD133 + 和CD34 + 细胞,明显高于新鲜的脐血。而CD14 ,CD61 ,CD3 和CD19 以及血型糖蛋白A 表达的变化与以前对CD34 + 细胞扩增研究的结果一致[5 ] 。随着培养时间的延长,CD133 + CD34 + 细胞有向CD133 - CD34 + 细胞分化的趋势,提示CD133 可能是较CD34 更为早期的HSPC 的表面标志。
端粒是细胞DNA 复制过程中不可或缺的重复
碱基序列,随着细胞的不断分裂和增殖,其端粒将逐渐缩短。而在一些永生的细胞系和肿瘤细胞中,其端粒酶得到一定程度的激活,使得端粒保持相对稳定, 而保持细胞具有相对稳定的分裂和增殖能力[12 ] 。造血干/ 祖细胞的端粒酶活性如何报道较少。有人认为移植的成功与否除了与输入的HSPC的数量有关外, 还与HSPC 端粒的长短密切相关[13 ] 。本研究显示,新鲜纯化的处于静止状态( G0/G1 期) 的HSPC 的端粒酶活性较低,但高于CD34 -细胞。在HGF 的作用下细胞进入增殖循环时,端粒酶活性明显上调,但随着扩增时间的延长又逐渐下降,表明在静止期HSPC 的端粒酶活性较低,在扩增的早期,端粒酶活性较高,细胞的增殖活性较强,随着扩增时间的延长,细胞逐渐分化成熟,其端粒酶活性逐渐下降,而使细胞丧失增殖能力。因此,HSPC的体外扩增不仅要获得足够数量的细胞,同时更要重视扩增细胞的质量,即要获得具有较强增殖活力的细胞。端粒酶活性可作为扩增细胞增殖能力的一个重要的参考指标。粘附分子不仅是HSPC 粘附定居到骨髓基质微环境增殖和分化的关键分子,而且在移植的HSPC归巢中也起非常重要的作用。其中HSPC 可通过CD49d 和CD11a 与骨髓内皮细胞膜上的CD106 和CD54 结合,使得移植的HSPC 能够粘附和穿过骨髓窦的内皮[14 ] 。另外,CD49d 与骨髓基质细胞膜上的CD106 结合对于HSPC 定居于骨髓造血微环境并增殖具有重要的作用。有研究显示, 扩增的HSPC 的移植常导致植入延迟[15 ] ,这一结果促使我们进一步研究脐血CD133 + 细胞的体外扩增是否会影响细胞粘附分子的表达。本研究结果显示,在扩增的早期阶段,CD49d 表达有明显的上调,CD11a始终保持较高水平的表达,而CD54 和CD62L 则有下调趋势。同时随着扩增时间的延长所有粘附分子的表达均有不同程度的下调。因此,应控制好扩增的时间。在整个扩增过程中, 有核细胞中的D34 +细胞亚群表达的这些粘附分子则无明显变化,提示扩增中粘附分子下调主要发生在那些较晚期的造血祖细胞。这可能是造成扩增HSPC 的延迟植入的原因之一,而对较早期的造血干细胞粘附分子的表达并无明显影响,这对扩增产物中造血干细胞的归巢尤为重要。致谢: 感谢余韵和贾培敏在流式细胞术检测方面给与的热情帮助和指导
参考文献
1 Goodell MA , Rosenzweig M , Kim H , et al . Dye efflux studies sug2 gest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectablen levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med , 1997 ; 3 :1337 - 1345
2 Bhatia M , Bonnet D , Murdoch B , et al . A newly discovered class of human hematopoietic cells with SICD2repopulating activity. Nat Med , 1998 ; 4 :1038 - 1045
3 Zanjani ED , Almeida2Porada G, Livingston AG, et al . human bone marrow CD34 - cells engraft i n vivo and undergo multilineage ex2 pression that includes giving rise to CD34 + cells. Exp Hematol , 1998 ; 26 :353 - 360
4 Sato T , Laver J H , Ogawa M , et al . reversible expression of CD34 by murine hematopoietic stem cells. Blood , 1999 ; 94 :2548 - 2554
5 郝思国,孙关林,孙 立. 脐血CD34 + 细胞扩增中系特异性分化抗原的变化. 中国肿瘤生物治疗学杂志,2001 ; 8 :248 - 252
6 Norol F , Drouet M , Mathieu J , et al . Ex vivo expanded mobilized peripheral blood CD34 + cells accelerate hematological recovery in a baboon model of autologous transplantation. Br J Haematol , 2000 ;109 :162 - 172
7 Shpall EJ , Quinones R , Giller R , et al . Transplantation of adult and pediatric cancer patients with cord blood progenitors expanded ex vivo. Blood 2000 ; 96 (suppl) : 207a
8 Paquette RL , Dergham ST , Karpf E , et al . Ex vivo expanded un2 selected peripheral blood : progenitor cells reduce posttransplantation neutropenia , thrombocytopenia , and anemia in patients with breast cancer. Blood , 2000 ; 96 :2385 - 2390
9 Yao M , Fouillard L , Lemoine FM , et al . Ex2vivo expansion of CD342positive peripheral blood progenitor cells from patients with non2Hodgkin′s lymphoma : no evidence of concomitant expansion of contaminating bal2/ J H2positive lymphoma cells. Bone Marrow Transplant , 2000 ; 26 :497 - 503
10 De Wynter EA , Buck D , Hart C , et al . CD34 +AC133 + cells iso2 lated from cord blood are highly enriched in long2term culture2initia2 ting cells , NOD/ SCID2repopulating cells and dentritic cell progeni2 tors. Stem Cells , 1998 ; 16 :387 - 396
11 Goussetis E , Theodosaki M , Paterakis G, et al . A functional hie2 rarchy among the CD34 + hematopoietic cells based on i n vit ro proliferative and differentiative potential of AC133 + CD34 + ( bright ) and AC133 (dim/ ) - CD34 + human cord blood cells. J Hematother stem cell Res , 2000 ; 9 :827 - 840
12 Kim NW, Piatyszek MA , Prowse KR , et al . Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science ,1994 ; 266 : 2011 - 2014
13 Nakamura TM , Morin GB , Chapmam KB , et al . Telomerase catalytic subunit homolog from fission yeast and human. Science ,1997 ; 277 :955 - 959
14 Yong K, Fahey A , Reeve L , et al . Cord blood progenitor cells have greater transendothelial migratory activity and increased responses to SDF21 and MIP23beta compared with mobilized adult progenitor cells. Br J Haematol , 1999 ; 107 :441 - 449
15 Guenechea G, Segovia JC , Albella B , et al . Delayed engraftment of nonobese diabetic/ severe combined immunodeficient mice transplan2 ted with ex2vivo expanded human CD34 + cord blood cells. Blood ,1999 ; 93 :1097 - 1105
上海第二医科大学附属瑞金医院、上海血液学研究所干细胞实验室,上海200025
