胞内pH值在细胞凋亡中的研究进展
边肖海 霍静 郑曙明 《长治医学院学报》 2004 年 12 月 第 19 卷 第 4 期
关键词 细胞内pH值;胞内酸化;细胞凋亡
进入20世纪90年代，由于细胞凋亡的特殊生物学意义，细胞凋亡的研究手段再次引发了发育生物学、细胞生物学、免疫学、分子生物学、肿瘤学和老年学研究者的广泛兴趣，形成了一个新的研究热点。由于各种物理和化学刺激诱导的细胞凋亡都同时出现细胞内酸化，这种细胞酸化与细胞凋亡之间的关系就成为人们关注的热点，阐明两者之间的关系无论对于细胞生长机制或是对于用药物干预细胞内pH进而影响细胞凋亡都具有重要意义 ［1］ 。
1 细胞内酸化与细胞凋亡之间存在某种特定关系
1.1 影响核酸内切酶的活性
许多细胞内存在酸性核酸内切酶，如DNA酶Ⅱ，其酶活性pH7.0以下的环境中明显增强。该酶被认为是介导细胞凋亡过程中核小体DNA裂解的主要酶，说明细胞内酸化可能通过增强细胞内酸性核酸内切酶的活性，而使细胞内核小体DNA裂解形成凋亡细胞核DNA的“梯形带”。在许多类型的细胞凋亡中，胞内离子浓度的改变与核酸内切酶的激活以及由此导致的核小体之间的DNA断裂有关。但是也有相反的报道。Boyle KM，Irwin JP，Humes BR，Runge SW. ［2］ 曾用C3H-10T1/2细胞研究了胞内pH值在凋亡的起始和进程中的作用，当H + 离子载体工作使胞内pH值接近6.0或更低时，6h内出现了一个明显的低凋亡诱导水平，然而，当接近6.75时却没有诱导出明显的凋亡变化，这个现象一直持续至36h发生酸化。酸化的细胞呈现了典型的凋亡形态学特征和染色体凝集，类似于血清缺乏细胞，但在做基因组DNA电泳时没有出现核小体之间DNA断裂。他们的结果也提示了在TPA（the12-0-tetradecanoylphorbol-13-ac-etate）介导的抑制血清缺乏的C3H-10T1/2细胞凋亡作用中，是与连续激活蛋白激酶C和Na + /H + 离子交换器导致的碱化或酸化抑制有关的。缺乏血清本身似乎不会对蛋白激酶C和Na + /H + 离子交换器起反作用，TPA也能够用特异的抑制剂来抑 制诱导细胞凋亡，但是只有在加入酶抑制剂20min后再加入TPA，这种抑制作用才是成功的。这些结果提示了C3H-10T1/2细胞的凋亡是沿着胞内酸化的途径进行，与核酸内切酶活性是无关的。
1.2 影响原癌基因在凋亡过程中的作用
研究结果表明，原癌基因在干扰细胞凋亡过程中也导致了细胞内pH的改变。Bcl-2在Jurkat T原始淋巴细胞的表达，明显对抗由放线菌酮诱导的细胞凋亡，而在这一保护作用过程中，放线菌酮诱导的细胞酸化也受到抑制。而在CHO细胞中，Bcl-2和Mcl-1的表达，也能抑制由蛋白激酶抑制剂staurosporine诱导的细胞凋亡和胞浆的酸化。正常鼠肾细胞Ha-ras基因表达，则能抑制TNFα诱导的细胞凋亡，它与核酸内切酶活性有关。可见，细胞凋亡过程中，出现细胞内pH的改变;并且，抗凋亡基因的抑制凋亡作用的强度与细胞内酸化程度相关。
1.3 影响细胞凋亡发生率
细胞内酸化程度与细胞凋亡发生率密切相关，它作为细胞凋亡的一个重要特征，已被许多学者认同。在由放线菌酮、紫外线、FasL及Lovastain等外源性刺激物诱导的细胞凋亡中，用流式细胞仪测定发现每种诱导物处理的Jurkat细胞和HL-60细胞都存在两类细胞，即pH正常和酸化的细胞。这两类细胞的细胞内pH差值约为0.5，被酸化细胞内的pH值约为6.7～6.9;另一方面，不同诱导物诱导细胞酸化的程度不同，表现在它们诱导细胞内酸化百分率的差别上。酸化细胞的百分率总是等于或大于出现亚二倍体DNA细胞的百分率，并且总是那些酸化的细胞易出现凋亡。各种诱导物诱导细胞内酸化的程度与它们诱导凋亡的作用程度相关，FasL诱导的细胞酸化作用量明显。其细胞毒性作用也最强，而放线菌酮和紫外线诱导的细胞酸化作用较弱且诱导的凋亡细胞数也较少。Lo-vastain则能产生剂量依赖性的细胞内酸化和细胞凋亡。
1.4 细胞内的碱化可拮抗细胞凋亡
既然细胞内酸化与细胞凋亡密切相关，那么细胞内碱化应对细胞凋亡产生相反的影响。细胞浆碱化可对抗细胞凋亡，用咪唑和氯奎对细胞进行碱处理，能对抗由FasL、放线菌酮、紫外线诱导的Ju-rkat细胞凋亡，表现为细胞DNA亚二倍体明显减少;同时，胞浆的酸化受到明显的抑制，单纯应用特异性钠氢交换抑制剂EIPA在20μmol/L～80μmol/L的剂量下可使HL-60细胞产生剂量依赖性的细胞酸化和细胞凋亡。
2 胞内pH值的调节机制
细胞在实体瘤中酸性的环境下可以通过活化膜上的离子交换器，包括Na + /H + 离子交换器、依赖于Na + 的Cl - /HCO 3- 交换器来维持胞内的pH值。抑制这些规律的离子交换机制已经被提议用作肿瘤治疗的手段。
2.1 特异性Na + /H + 交换抑制剂通过抑制Na + /H + 交换体使细胞内酸化可诱导凋亡
Rich IN，等 ［3］ 证明了从白血病患者体内获得的白细胞系及外周淋巴血细胞有着比正常造血组织细胞普遍的、具有统计学意义的高的pH值。说明了在胞内pH值与正常造血细胞和白血病细胞的细胞周期调控之间存在一种直接的关系。利用这种关系，他们用Na + /H + 交换体的抑制剂5-（N，N-hexamethylene）-amiloride（HMA）处理白血病细胞，降低了胞内pH值，从而诱导了细胞凋亡。体外用一定剂量HMA孵育白血病细胞5h，用流式细胞仪和荧光显微镜观察:当胞内pH值较低时，用膜蛋白Ⅴ和TUNEL快速方法测定凋亡细胞增加，大约90%的白血病细胞被杀死。正常细胞和白血病细胞对HMA的不同敏感性，提示Na + /H + 交换体的抑制剂可以作为一种有潜在能力的抗白血病的药。
金丝桃素是一种抗逆转录病毒和抗肿瘤药物，在金丝桃素环境中，它有多种光诱导方式与一氧化物或活化的质子结合，导致pH值降低。Mirossay L，Mirossay A，Kocisova E，等 ［4］ 的研究证明在HL-60细胞中金丝桃素的作用被omeprazole（H + /K + -ATPase抑制剂）和利尿剂（Na + /H + 交换器抑制剂）显著增强。他们的结果支持活化质子以及随后的金丝桃素环境中的酸化在金丝桃素的生物学功能中起着重要的作用。此外，omeprazole和利尿 剂都有效地增强了金丝桃素对HL-60细胞的毒素作用。
2.2 Na + -HCO 3- 协同运输器与Cl - /HCO 3- 交换器的改变与细胞凋亡之间的关系
Wong P，Kleemann HW，Tannock IF.报道 ［5］ ，用人类细胞（MCF7，MDA-MB231）和鼠类的乳腺癌细胞（EMT6）作为供试细胞，测试了两种试剂cariporide（Na + /H + 交换器的抑制剂）和S3705（Na + 依赖的Cl - /HCO 3- 交换器抑制剂）调整胞内pH值得作用，结果说明cariporide有着接近于利尿剂抑制Na + /H + 交换器的作用，同时S3705是一种更有潜能的抑制依赖于Na + 的Cl - /HCO 3- 交换器的药物。这两种药剂在pH值为7.0h～6.8h可以抑制肿瘤细胞的生长，但是在内向调节pH值的剂量下对生长的细胞无毒性。他们的结果说明体外条件下cariporide和S3705是可选择性的细胞生长抑制剂，也反映了在实体瘤中有轻度酸化的微环境。
囊性纤维化调节器（CFTR）对胞内pH值有潜在的影响，Barriere H，Poujeol C，等 ［6］ 使用了通过转染缺失Na + /H + 离子交换器（NHE1）的PS120中国仓鼠肺纤维原细胞，允许CFTR和NHE1表达。Lovastatin诱导的凋亡动力学用地衣红染色、Hoechst-33258和二碘化丙啶双染色、DNA断裂以及标记膜蛋白-V等指标测定。在对照细胞PS120中，用lovastatin处理40h后，凋亡细胞的百分数比CFTR转染的PS120细胞中的低。在PS120NHE1细胞中用CFTR转染40h后没有改变凋亡细胞的百分比，说明通过NHE1的过表达来封闭胞内酸化阻止了由CFTR诱导的凋亡增强趋势。所用细胞用lovastatin处理后出现了酸化。但是，处理40h后CFTR转染的PS120细胞的pH值比PS120细胞的pH值低。为了进一步探索CFTR转染的PS120细胞酸化增强的原因，他们研究了DIDS（Cl - /HCO 3- 交换器抑制剂）。用8-Bromoadeno-sine3'，5'-cyclic一磷酸盐孵育CFTR转染的PS120细胞导致了Cl - /HCO 3- 交换器的活化，而在PS120细胞中没有这种现象。结果提示CFTR能增加中国仓鼠肺纤维原细胞的凋亡可能是由于调整了Cl - /HCO 3- 交换器，从而导致了更有效的胞内酸化。
Porcelli AM，Scotlandi K，等 ［7］ 通过在HEPES和HCO 3- /CO 2 缓冲液中加入2'，7'-bis（2-car-boxyethyl）-5（6）carboxyfluorescein酯，通过控制Cl - 和Na + 的梯度，来研究了U2-OS骨肉瘤细胞胞内pH值调整的分子机制。发现酸化和碱化对于阴离子交换器抑制剂的敏感性都很弱。但是对于Na + /H + 交换器的抑制剂—利尿剂的敏感性却很高。此外还发现了另一种H + 泵出的机制—Na + 依赖的HCO 3- /Cl - 交换器。
Gleeson D，Smith ND，Boyer JL.等 ［8］ 使用pH敏感的染料BCECF和连续灌注肝细胞下层的单层培养细胞，研究了小鼠肝细胞胞内pH值在+HCO 3- 和-HCO 3- 碳酸盐时的变化情况。在+HCO 3- 时pHi比-HCO 3- 时高。+HCO 3- 时，用利尿剂封闭Na + /H + 离子交换器对胞内pH值没有影响，但-HCO 3- 时出现了酸化。快速用Na + 替换+HCO 3- 也会引起酸化，这种酸化是利尿剂依赖而DIDS可以抑制的。得出的结论:除Na + /H + 转化器外，Na + -HCO 3- 协同运输器在鼠肝细胞中也是一个重要的胞内pH值调节器。
2.3 单纯的碱处理可以对抗诱导剂诱导的细胞凋亡
Kurtz I，Golchini K ［9］ .验证了Cl - 离子交换器在Madin-Darby犬肾细胞的单层细胞中调整pHi中的作用。细胞在25mM HCO 3- pH7.4时，用pH探针BCECF测得稳定的pHi是7.10±0.03（n=14）。急速碱化后pHi在约4min内呈指数式恢复。这种速度比起剔出Cl - 或HCO3 - 或在50mM的DIDS时的回复率明显的降低。碱化后用Na + 或10 -3 M利尿剂不能抑制pHi回复。急速胞内酸化后，使用10 -3 M的利尿剂可以明显地抑制pHi回复，但是剔出Cl - 或在50mM的DIDS中没有改变。得出一个结论:Madin-Darby犬肾细胞拥有一个Na + 依赖的Cl - -HCO 3- 交换器，Cl - -HCO 3- 离子交换器在当胞内pH值高于大约7.1时，在调节胞内pH值方面起着重要的作用。胞内酸化后胞内pH值的恢复是由Na + /H + 交换器介导的，而不是由阴离子交换器介导的。
综上所述，在生长因子依赖的细胞株凋亡过程中普遍存在细胞内酸化，细胞内酸化是细胞凋亡过程中的一种细胞内信号变化，它促进细胞凋亡已有以下几方面的事实所支持:①特异性Na + /H + 交换 抑制剂通过抑制Na + /H + 交换体使细胞内酸化可诱导凋亡，除Na + /H + 交换器外，Na + -HCO 3- 协同运输器与Cl - /HCO 3- 交换器的改变也与细胞凋亡关系密切，细胞浆酸化程度与细胞凋亡发生率存在量效关系;②单纯的碱处理通过减少胞内酸化程度而表现出对抗诱导剂诱导的细胞凋亡;③细胞内存在酸性核酸内切酶，细胞内酸化能激活该酶，触发核小体DNA裂解，该酶是细胞酸化介导细胞凋亡的一个重要物质基础;④许多与细胞凋亡有关的酶和蛋白质的活性在酸性环境中增强。但是细胞内酸化在细胞凋亡中的意义仍有待阐明。
参考文献
1.彭黎明，王曾礼主编.细胞凋亡的基础与临床.第1版.北京:人民卫生出版社，2000，7
2.Boyle KM，Irwin JP，Humes BR，Runge SW.Apoptosis in C3H-10T1/2cells:roles of intracellular pH，protein kinase C，and the Na + /H+ antiporter.J Cell Biochem.1997，Nov1，67（2）:231～40.
3.Rich IN，Worthington-White D，Garden OA，Musk P.Apoptosis of leukemic cells accompanies reduction in intracellular pH after targeted inhibition of the Na + /H + exchanger.Blood.2000，15，95（4）:1427～1434
4.Mirossay L，Mirossay A，Kocisova E，Radvakova I，Miskovsky P，Mojzis J.Hypericin-induced phototoxicity of human leukemic cell line HL-60is potentiated by omeprazole，an inhibitor of H + K + -ATPase and5'-（N，N-dimethyl）-amiloride，an inhibitor of Na + /H + ex-changer.Physiol Res.1999，48（2）:135～141
5.Wong P，Kleemann HW，Tannock IF.Cytostatic potential of novel a-gents that inhibit the regulation of intracellular pH.British Journal of Cancer，2002，Jul15，87（2）:238～245
6.Barriere H，Poujeol C，Tauc M，Blasi JM，Counillon L，Poujeol P.CFTR modulates programmed cell death by decreasing intracellular pH in Chinese hamster lung fibroblasts.Am J Physiol Cell Physiol，2001，281（3）:C810～824
7.Porcelli AM，Scotlandi K，Strammiello R，Gislimberti G，Baldini N，Rugolo M.Intracellular pH regulation in U-2OS human osteosarcoma cells transfected with P-glycoprotein.Biochim Biophys Acta，2002，30，1542（1-3）:125～138
8.Gleeson D，Smith ND，Boyer JL.Bicarbonate-dependent and-in-dependent intracellular pH regulatory mechanisms in rat hepatocytes.Evidence for Na + -HCO 3- cotransport.J Clin Invest，1989，84（1）:312～321
9.Kurtz I，Golchini K.Na + -independent Cl - -HCO 3- exchange in Madin-Darby canine kidney cells.Role in intracellular pH regulation.J Biol Chem，1987Apr5;262（10）:4516～4520
