肾综合征出血热患者T淋巴细胞亚群动态变化分析
秦靖；张淑琴；关小萍；刘顺爱
摘 要 目的：探讨外周血T淋巴细胞在肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)发病进程中的意义，为HFRS发病机理研究和指导临床治疗提供实验室依据。
方法：用流式细胞术动态观察不同病期HFRS患者外周血CD4+ 和CD8+ T 淋巴细胞。使用BD公司的CD3 /CD8 /CD45 /CD4 四色荧光标记单克隆抗体和TruCOUNT 样品检测管。经MultiSET自动分析软件分析，可以得出T淋巴细胞亚群的绝对数和相对数。
结果：发热期HFRS患者外周血T淋巴细胞亚群的绝对数比较分析显示：CD3+ 淋巴细胞数显著升高，为2078±688/μl（与正常对照组相比P﹤0.01）；CD3+CD4+ T淋巴细胞数显著下降，为781±170/μl（与正常对照组相比P﹤0.05）；CD3+CD8+ T淋巴细胞数显著升高，为1252±610/μl（与正常对照组相比P﹤0.01）。发热期CD4+/ CD8+ 比值显著下降，为0.750±0.340（与正常对照组相比P﹤0.01），到恢复期升至1.215±0.294，但仍未恢复至正常水平（P﹤0.05）。发热期HFRS患者外周血T淋巴细胞亚群的相对数比较分析显示：CD3+ 淋巴细胞为75.08±7.14%（与正常组和恢复期相比无显著性差异）；CD3+CD4+ T淋巴细胞相对数显著下降，为26.37±4.26%（与正常对照组相比P﹤0.01）；CD3+CD8+ T淋巴细胞显著升高，为46.44±7.62%（与正常对照组相比﹤0.01）。恢复期HFRS病人T淋巴细胞亚群向正常对照组接近，在相对数分析中未显示出显著性差异，但在绝对数分析中仍显示出显著性差异（P﹤0.05）。
结论：1)外周血免疫细胞的变化是HFRS患者机体内免疫状态的表象，为探讨SARS免疫学发病机理提供了可靠的依据；HFRS患者外周血T淋巴细胞亚群变化与其病程进展相符，为指导临床治疗提供了有效的实验室数据。2) 在抗感染细胞免疫研究中，外周血淋巴细胞亚群绝对数和相对数分析结果可以有不同的统计学意义，应综合分析其绝对数和相对数。
关键词：肾综合征出血热；T淋巴细胞亚群；动态变化
The Analyse of T lymphocyte in Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome
秦靖 张淑琴 关小萍 刘顺爱
北京地坛医院 北京100011
Jing Qin, Shuqin Zhang, Xiaoping Guan and Shunai Liu
Beijing Ditan Hospital , Beijing 100011
ABSTRACT
Objective: To evaluate the role of T lymphocytes in hemorrhagic fever with renal syndrome(HFRS)patients.
Methods: T lymphocytes in the Peripheral blood was detected by Flow Cytometry in 16 patients with HFRS.
Results: The T lymphocyte in febrile phase HFRS patients showed that T cell(CD3+) counts increased significantly(2078±688 cells/μl ,compared to normal control P<0.01),CD3+CD4+ T cell counts decreased significantly(781±170 cells/μl, compared to normal control P<0.05)，the CD3+CD8+ T cell counts increased significantly (1252±610 cells /μl ,compared to normal control P<0.01) and the CD4+/ CD8+ ratio is 0.750±0.340(compare to normal control P<0.01).These changes were most obvious in returned gradually, but still abnormal in convalescent phase( P﹤0.05). There were no change in the percentages of T cells (CD3+) among different phases, the percentage of CD3+CD4+ T cells(26.37±4.26% ,compared to normal control P<0.01)decreased significantly and the percentage of CD3+CD8+ T cells (46.44±7.62%,compared to normal control P<0.01)increased significantly.
Conclusions: The T lymphocytes are related with the different phases of HFRS patients. The disturbance of cellular immune function may play an important role in the pathogenesis of HFRS and supply important data for therapy to the HFRS patients.
Key words：HFRS；T lymphocyte；Time course
1.研究对象：HFRS患者16例，其中男12例，女4例，年龄分布为18至57岁，平均年龄为42.3岁；所有患者的临床诊断均符合中华人民共和国国家标准，患者的外周抗凝血由保定市传染病医院提供。另选择11名健康志愿者设为正常对照组。
2.实验试剂及仪器：四色荧光标记单克隆抗体为BD公司的MultiTEST CD3 FITC/CD8 PE/CD45PerCP/CD4APC。红细胞溶解液为BD公司的FACSFLysing Solution。使用BD公司的FACSCalibur流式细胞仪及TruCOUNT 样品检测管。
3.免疫细胞检测方法：将20μl四色荧光标记单克隆抗体加入至TruCOUNT样品检测管，再加入50μl混匀好的新鲜抗凝血，混匀后室温避光孵育15分钟，之后加入450μl 10倍稀释的红细胞溶解液，室温避光孵育15分钟，最后上流式细胞仪检测各T淋巴细胞亚群的绝对数和相对数，分析软件为BD公司的MultiSET自动分析软件。
4.统计学处理：实验数据采用均值±标准差(X±S)表示，同一指标两样本均数间比较采用t检验。
我们用流式细胞仪对16例发热期HFRS患者、6例恢复期HFRS患者及11例健康志愿者外周血进行了T淋巴细胞亚群检测，并进行了比较分析。其中6例恢复期患者为16例发热期患者中的部分患者。因TruCOUNT 样品检测管中已加好已知数量的内参微球，所以MultiSET自动分析软件可以自动算出各荧光标记抗体相对应的淋巴细胞绝对数（每μl外周抗凝血中所含的相应细胞数，用细胞数/μl表示）和相对数（相应的T淋巴细胞亚群在外周血全部淋巴细胞中所占的百分比，用%表示）以及CD4+和CD8+ T淋巴细胞之间的比值（CD4+/ CD8+）。我们分别对不同病期HFRS患者外周血淋巴细胞绝对数和相对数进行了比较分析，其绝对数结果见表1，相对数结果见表2。
HFRS患者T淋巴细胞亚群绝对数结果（表1）显示：1）发热期HFRS患者的CD3+ T淋巴细胞显著高于恢复期病人和正常对照组，而恢复期病人和正常对照组间无显著性差异。2）发热期和恢复期HFRS患者的CD3+CD4+ T淋巴细胞均低于正常对照组，而发热期和恢复期HFRS患者之间无显著性差异。3）发热期和恢复期HFRS患者的CD3+CD8+ T淋巴细胞均高于正常对照组，并且发热期和恢复期HFRS患者之间也有显著性差异。4）发热期和恢复期HFRS患者的CD4+/ CD8+ 均显著低于正常对照组，并且发热期和恢复期HFRS患者之间也有显著性差异，发热期病人显示CD4+/ CD8+倒置。
HFRS患者T淋巴细胞亚群相对数结果（表2）显示：
1.发热期和恢复期HFRS患者的CD3+ 淋巴细胞与正常对照组间无显著性差异。
2.发热期HFRS患者的CD4+ T淋巴细胞显著高于恢复期病人和正常对照组，而恢复期病人和正常对照组间无显著性差异。
3.发热期HFRS患者的CD3+CD8+ T淋巴细胞显著高于正常对照组和恢复期患者，而恢复期病人和正常对照组间无显著性差异。
以上结果显示，不管是相对数还是绝对数，发热期HFRS患者CD8+ T淋巴细胞显著高于正常对照组、而CD4+ T淋巴细胞显著低于正常对照组，但淋巴细胞相对数和绝对数也有不同的统计学意义，叙述如下：
1.总T淋巴细胞（CD3+）只在绝对数分析中显示显著性差异。
2.恢复期HFRS病人T淋巴细胞亚群在绝对数分析中显示显著性差异，而在相对数分析中不显示显著性差异。
3.发热期HFRS病人CD4+ T淋巴细胞相对数分析比绝对数分析更有统计学意义，而CD8+ T淋巴细胞相对数分析和绝对数分析显示的统计学意义相同。
HFRS的发病机制目前尚未完全阐明，主要有病毒直接作用和免疫病理作用假说。汉坦病毒对人体细胞具有泛嗜性，引起病毒感染细胞的直接损伤，是发病的起始因素。HFRS病程的早期存在体液免疫亢进，在HFRS患者的肾小球基底膜发现抗原-抗体免疫复合物，在血清中可以检出循环免疫复合物，提示Ⅲ型变态反应在HFRS的发病机制中起很大作用。另一方面，在急性期汉坦病毒感染引起的细胞免疫与发病机制和免疫保护有重要关系，即机体特异性细胞免疫对于清除病毒感染起着重要作用的同时，在某些条件下，免疫效应细胞和其产生的多种细胞因子在清除病毒的过程中，可引起组织损伤，产生不同程度的病理损伤【1】。
本文结果显示不管是相对数还是绝对数，发热期HFRS患者CD8+ T淋巴细胞显著高于正常对照组、而CD4+ T淋巴细胞显著低于正常对照组，与其他研究报道相类似【2，3，4】。发热期HFRS患者T淋巴细胞（CD3+）在绝对数分析中显著高于正常对照组和恢复期病人，而在相对数分析中无显著性差异。原因可能是汉坦病毒感染引起总淋巴细胞数增加，而细胞免疫和体液免疫同时亢进造成淋巴细胞亚群比例不改变所致。另外，恢复期HFRS病人T淋巴细胞亚群在绝对数分析中仍显示显著性差异，而在相对数分析中不显示显著性差异；发热期HFRS病人CD4+ T淋巴细胞相对数分析比绝对数分析更有统计学意义，而CD8+ T淋巴细胞相对数分析和绝对数分析显示的统计学意义相同。我院作为传染病专科医院，长期进行病毒性肝炎、艾滋病、SARS等病毒感染性疾病的外周血淋巴细胞检测【5，6，7，8，9，10】。以往，我们偏向于分析T淋巴细胞亚群的绝对数，本文结果提示在抗感染细胞免疫研究中应综合分析T淋巴细胞亚群的绝对数和相对数的变化。
