血液分析仪使用的全面质量控制
结果(×109/L)
标本号 差值d
p Q
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1 7.5 7.8 -0.3
2 12.2 12.5 -0.3
3 3.4 3.4 0
4 18.7 17.9 0.9
: : : :
: : : :
10 5.7 5.9 -0.2
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（四）仪器的校正：
理想的仪器校正方法是取一份新鲜血液，经ICSH推荐的方法定值后，用其校下仪器的各项参数，以下介绍几种方法操作及注意事项：
１。ＨＢ测定──氰化高铁血红蛋白测定法；
（１）HiCN法的优点
HiCN法之所以被选为国际标准法,是因为其具备以下几个重要的特点:A.操 作简单,稀释液(试剂)为单一试剂.B.除SHb外其余Hb衍生物均可很快转为HiCN.C.HiCN在5540nm处吸收峰 较宽,可用一般分光光度计或滤光板比色计比色测定.D. 显色快而稳定,因此HiCN液可制成相当长时间(至少六年)稳定发生 不变的标准液.E. 可以通过比色 直接定值.
(2)实验原理
血红蛋白被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白再与氰结合成稳定的棕色氰化高铁血红蛋白,在规定的波长和液层厚度的条件下具有一定的消光系数.因此, 根据其消光度,即可求得HB浓度其化学反应式为:Hb+?K3[Fe(CN)6]-Hi;Hi+CN- -HiCN
(3)试剂
经典的HiCN法的二种常用试剂其配方为:
都氏液:KCN(50mg),K3[Fe(CN)6](200mg),NaHCO3(1g);
文-齐氏液:KCN(50mg),K3[Fe(CN)6](200mg),KH2PO4(140mg),storoX-100(5ml);
从配方可以看出,两种液基本成份一致,唯PH不同,都 氏液含有 PH8.5远离病理性血红蛋白（大多属于优球蛋白）的等电点，因此，检查这些病人时不易产生混浊，但反应时间过长（多数４０分钟才能比色）为其不足。反之，用文齐氏液 因ＰＨ较低，反应较快，３分钟后即可比色，但因其ＰＨ接近于病理性血清蛋白等电点，易产生混浊。目前国内外常用文 齐氏液做为常规使用。
（４）计算
因为HiCN在规定的 波长和液层厚度下，具的一定的消光系数（消光系数为４４）因此，测试条件都在标准状态时（仪器、比色杯、试剂稀释器）根据样品光密度即可求出Hb量。公式为:
OD 64458(mg)
------X──── X251=ODX36.77=Hbg/l
44 1000
(5) 有关HiCN质控 注意的问题
A.HiCN法优点之,就是通过比色可直接定值,即HICN比色光密度值X36.77,但使 用36.77这个常 数是有条件的, 即所测出光密度的分光光密度计波长范围必须十分准确,灵敏度高线好,无杂光,比色光程为1cm,衡释倍数为1:251.因此,仪器的校正是测定中珠关键,决定着测定结果的正确与否.校正分光光度计的方法很多,对于HiCN 测定最有效、最简单的校正方法是用特殊的ＨｉＣＮ标准校正液。因为这种液体有特殊的吸收光谱并可保持６ 年不变。因此，用同批号的标准液即可根据其光谱特性标定仪器，又可用其稳定性去监测已标准的仪器。校正在致有以下几个步骤：
ａ。波长：因为标准液最大吸收是540nm,因此,可将校 正液放在等待测光度计中,从500至580nm分几个波段测量其OD值,最大吸收在540nm,证明仪器波长准确, 否则调试仪器有关部分.但在实际工作中对波长偏差不太大的仪器, 可采用“将错就错”的办法,即可用HiCN标准液所得吸收光谱的最大吸 收是535nm,说明535nm是偏差,实际上是540nm,实际工作中即可用535nm进行测定.
b.灵敏度:并非所有的仪器灵敏度均能达到实验条件.因此使 用的721分光光度计必须经过“浓度换算”求出校正系数。 方法为：在质控部门购买一套标准HiCN校正液,具有5g、10g、15g、20g四种浓度。在标准的仪器上，这四种浓度的溶液OD值分别为0.153、 0.271、 0.407及0.543。将这四种溶液分别在待测仪器上比色， 即可得该仪器的测定光密度，然 后根据
￥OD(理论值)
Ｋ＝────── 的公式求出该仪器的校正系数(K值). 常规工作时病人血光 $OD(测定值)
密度X36.77 X K值就是病人HB实际浓度.
C.杂光:杂光的增加意味着单色光的纯度减低,因而使HICN在吸收峰处吸光度下降,504处形成波谷,是HB测定在一定范围内灵敏度最低的波长, 故杂光对其影响不大.因此杂光可使 HICN吸收光谱的Q值减低(见表一)
表一不同杂光水平的Q值
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杂光水平 1.5 1.9 6.0 12.5 20
Q 值 1.6 1.59 1.55 1.47 1.38─────────────────────────────
因此观察标准校正液Q值,可了解仪器杂光程度.
D.线性: 在仪器性能测定时,常用一种在一定波长范围内,确知其服从Bccr 定律的有色物质配成不同浓度来检查仪器本身是否能如实反映浓度变化, 这就是仪器的线性检 查.Hb测定用的分光光度计线性了也可用HiCN来检查. 方法是将已知浓度的HICN液准确稀释成各种浓度.分别比色,然后以每个稀释液浓度(g%)为横座标, 比色的光密主工为纵座标,交各点连线,如仪器性能好,各点连线应为直线.如有各别点不在直线上,作用时应使 直线通过尽量多的点, 交不在直线上的点光密度与所代表的浓度在直线的光密度比较,如两者之差在5%以内,则可认为仪器符合线 性要求.
E.比色杯:比色杯的厚度及透光性是影响实验的又一因素.厚度可用卡尺鉴定, 若不是1cm,则比色结果应乘以校正系数1cm/厚度. 透光度可用下述方法测定. 溶解0.2MG伊文氏兰于100ml蒸馏水中,放入所有待测比色杯内,用一比色杯做标准,将仪器读数准确调 到50%T(透光度),将其它比色杯逐一与标准杯比较读数时应反复交替测定标准杯与待测杯的透光度,尽量减少仪器漂移的影响,比色杯透光度,在50%T++ 0.5%内者为合格,标记比色杯的透光面.以便在以后应用中,使 同一侧面向光源 .
(二)试剂问题
1.测定某些含有病理性蛋白血液HB时,试剂的处理,前已述及,经典的HICN 法的试剂有两种,都氏液和文齐氏液.前者含NAHCO3:呈碱性,病理血液(肝硬变、白血病、 肾病)加入后不产生混浊，但需在１５ＯＣ条件下４０分钟后才使Hb完全转化成HiCN,文齐氏液虽显色快,但因是低离子强度溶液且PH 接近而产生混浊的病理球蛋白的等电点,围绕着上述问题许多学者做了深入的的研究,Vanzitti发现产生混浊的蛋白属于优球蛋白,,其特点是溶解度低,在低离子溶液中易沉淀.正常人血浆在PH4.5--6.5环境中可发生混 浊,而病 理血清可在PH>7.0条件下发生(见图一).进一步研究证实,如在试剂中加入NnCL增加其离子强度,可抑制这种混浊发生.但Mafsufoara发现加入NaCL虽可抑制沉淀,但因改变了HiCN的Q值影响了结果的准确性, 这种变化可以通过调 整KH2PO4的浓度 ,改变PH范围,使Q值仍保持在正常范围内, 即在NaCL 浓度为0.50g/L时应加入KH2PO430-180mg/L;60-160mg/L;100-180mg/L,使PH在6.5-9.5;6.5-8.5;6.5-7.2范围,可使Q值在1.59-1.63范围内(见图二).改变的文齐氏液与病理血液的结果见表二.
