准确计数血小板的方法学研究
朱 忠 勇
南京军区福州总医院全军检验中心
一、问题的提出
(一)血小板计数，过去主要是用于临床诊断，但现代临床实践中，更加重视输注血小板的治疗作用。目前血小板输注日益增多，由于价格昂贵和存在风险，国外有降低血小板输注起点(trigger point or threshold)的趋势，因而要求准确计数血小板。
(二)迄今为止，所有计数血小板的方法均不够理想，亟待改进。
二、计数血小板技术上的难点
（一）血小板体积小，且体积之间相差较大，自2fL至30fL(平均5－7fL)，其体积分布图不是正态，而是向右侧延伸（见图），即一般人都存在数目和大小不等的大血小板。
血小板易粘附和聚集。在血管被剌破后，血小板以极快的速度粘附于血管破损处，因此，不管用何种方法采血，所得血小板数都较血液中实际血小板数为低（皮肤穿刺采血尤甚）。在不加抗凝剂的血片中，血小板大多是几个聚集在一起的,推片延迟时间越长，聚集越明显。如果采血不顺利，血小板被活化，或血有部分凝结，血小板也会聚集。有一种人称为血小板EDTA聚集者(EDTA Clumper)，其血小板在用EDTA抗凝剂时反而会聚集，国内外均已有多例报道（纠正的方法，可改用枸橼酸钠抗凝） 。血小板一旦聚集，将造成血小板假性减少。
（二）目前的计数血小板的方法，对于血小板减少的标本，往往难以得到准确的结果。
1.WHO推荐的参考方法 ─ 10g/L的草酸铵，相差显微镜计数法，本身有很多缺点。
2.现有的通用的血液分析仪，无论是阻抗法还是激光散射法，都是基于体积大小来区分细胞的，这对于血小板数正常的标本，一般可得到比较准确的结果，但对于血小板减少者计数误差甚大，其原因:
■ 血液中的非血小板颗粒（nonplatelet particles,NPPs)如病理情况下的小红细胞及红细胞碎片、白细胞碎片等，由于 其大小近似血小板，可使计数结果偏高。
■ 大血小板因其大小已达红细胞水平，往往被当作红细胞，致使血小板计数偏低。
三、当前正在研究或已进入实际应用的准确计数血小板的方法
（一）免疫学方法(immunoplatelet counting)
本法早在1988年即已由Aulter等提出，但最近几年才进入实用，并被认为是当前最可靠的实用方法或参考方法。
这种方法虽有较高的准确性，但方法多比较繁琐，又要较昂贵的仪器和试剂，不太适合大量的常规工作，仅可用于某些特殊需要的病例以及建立参考方法、校正仪器等。
（二）二维激光散射(two -dimensional laser light scatter)法
这是Bayer公司在其Advia 120型血液分析仪上首先采用的新方法。原理：用一束激光照射血小板，然后在两个不同的角度对激光散射强度进行测定。高角度（5°～15°)测细胞的折射指数（refractive index，RI)，它与细胞的密度有关；低角度(2°～3° )主要测细胞的体积大小。血小板的体积在2～30fL。RI在1.35～1.40之间，而红细胞因含高浓度血红蛋白，
其RI值高（可达1.44)，故与大型血小板和小红细胞及碎片，在二维散点图上均可区分。
二维法在一般五分类的血液分析仪上，早已用于对白细胞的分类，但用于血小板计数是Bayer公司自Advia 120型仪器开始。
本法不需要特殊的仪器和试剂，它可在通用的血液分析仪上上常规使用。它不仅可以区分NPPs，还可计数大血小板，解决了上述血小板假性增加和减少的大部分问题，故计数结果比较准确。
四、对新方法的评价
最近几年，国外一些杂志已发表了好几篇对于上述两类方法评价的文章。每篇文章不仅对方法的精密度、线性等进行了观察，而且与“参考方法”、一般的阻抗法和一维的激光散射法进行了一系列的比较，总的结果相当满意。
五、存在的问题及展望
准确计数血小板尽管已取得很大进展，但并非十全十美，存在问题仍不少。
（一）免疫学方法，现有的方法不仅难以在常规工作中普遍采用，而且对于血小板膜糖蛋白异常的患者不适用（如Glanzmann血小板无力症）。
（二）二维激光散射法，对于RI相近的白细胞碎片与血小板的鉴别能力如何尚不得而知。对于大块聚集的血小板的计数和鉴别也是未知数。
（三）间接计数法, 由于“参考方法”本身精密度和准确性不高，又缺少其它评价各种方法准确度的客观标准。
有人提出一种新的“间接法”来验证和补充其它方法。具体操作步骤是：用抗凝静脉血推一血片，经瑞氏染色后在镜下计数1000个红细胞时所见到的血小板数，求出血小板/红细胞之比值，将此比值×红细胞数（通过血液分析仪计数求得）即为血小板数。此法较费时，也不十分精确，但比较直观，同时还可观察血小板的大小和形态，特别是观察大血小板。一般正常血小板直径为1～4μm（可与近傍红细胞比较，正常红细胞直径在7μm左右），Gill将大血小板分为大血小板(macroplatelet直径4～6μm)和巨血小板(giantplatelet，直径6μm以上)两类。大血小板被认为是年幼的血小板，其活力更强。有报道，血小板减少性疾病、心肌梗死等血栓性疾病、糖尿病等，大血小板会增加。其临床意义，值得进一步研究。
