血细胞参数检测的参考方法及其应用
中国医疗2003第4期
□文/彭黎明 成都华西医科大学附属第一医院检验科主任 本刊编委
全血细胞计数是血液学常规检查项目，对血液系统及其相关疾病的诊断和治疗十分重要。由于血细胞分析仪的计数结果重现性好、准确，操作简便、快速，已成为当今临床实验室全血细胞计数的主要检测手段。但目前的自动化血细胞分析仪被认为是非直接计数的仪器，在使用时须对其进行校准，才能保证其分析结果的准确性，而校准血细胞分析仪所测参数需用相应的参考方法。
按照国际血液学标准化委员会(ICSH)的定义，参考方法是“已被清楚而确切地描述、用于某一特定检测的方法，它可以按照指定权威机构的判定，提供准确度和精密度足够高的试验数据，以对该检测的其他实验室方法进行评估。参考方法应遵循基本的计量学标准，其准确度必须通过与现有的一种确定方法相比较而确定，并且必须明确指出其不精确度和不准确度”。除用于评价常规方法和校正仪器外，参考方法也可用于质控品定值及鉴定商品试剂盒等。与常规方法相比，参考方法的干扰因素少，系统误差小，相对于常规方法可忽略不计，因其技术要求较高且费用较昂贵，在常规临床实验室应用不多，但对保证常规方法结果的可靠性非常重要。目前，ICSH和美国临床检验标准化委员会(NCCLS)已经建立了红细胞和白细胞计数、血红蛋白测定、红细胞压积测定、网织红细胞计数、血小板计数及白细胞分类计数的参考方法。现对这些参考方法及其应用予以简述。
1.红细胞（RBC）和白细胞（WBC）计数
红细胞和白细胞计数传统的参考方法是直接计数法，即在计数池内对稀释血液进行的红细胞和白细胞直接计数。由于血液稀释的准确性和充池的一致性不易掌握，结果会产生较大的误差，且当细胞浓度过低时难以得到准确的结果。该法在一般临床实验室中计数红细胞的不精密度（CV）可达5%~10%，而在生理条件下计数白细胞的CV值为6％－9％，已不适于作为参考方法。ICSH推荐使用电阻抗法半自动单通道细胞计数仪计数代替传统的直接计数法，并在1994年对此进行了修订，将其确定为参考方法。
现行红细胞和白细胞计数的参考方法，是将血液稀释一定倍数后用ICSH推荐的计数仪计数一定体积内的细胞数，并换算成每升血液内的细胞数。计数白细胞时，用白细胞稀释液溶解红细胞。标本是用EDTAK2抗凝的静脉血，EDTAK2的最终浓度为1.5－2.2mg/ml。测定时不能用溶血或有微凝块的标本。同时，盛血容器体积要合适，以有足够的空间混匀血液。测定前将容器轻轻倒转几次混匀血液，但不能用旋涡混匀器。计数仪通道直径80－100μm，通道长度为直径的70%－100%，仪器信噪比大于100:1。
稀释标本时应使用符合国家标准的容量瓶，计数白细胞时要用稀释液将红细胞完全溶解。除标本采集，标本运输及标本稀释可使结果产生误差外，测量时的误差来源主要包括吸入血液的体积不准、通道内细胞再循环、细胞粘附、假信号以及重合计数等。重合计数为主要的误差来源，目前多通过回归分析方法进行校正，假信号则通过设置阈值进行消除。
ICSH所制定的参考方法计数红细胞和白细胞的最大允许偏差分别为2.0%和4.0%，计数不精确度小于1%。
2．血红蛋白（Hb）测定
血红蛋白测定的方法很多，包括比色法、比重法、血铁法、血氧法等，其中以比色法为主。1966年ICSH就已推荐氰化高铁血红蛋白（HiCN）法为血红蛋白测定的首选方法，既作为参考方法，也可常规使用。该法精确度和准确度都很高，最大允许误差为1%，其他方法如十二烷基硫酸钠测定法、叠氮高铁血红蛋白法等都必须通过HiCN法校正其结果。以后ICSH又多次重申了该法]。
HiCN法是用HiCN转化液与血红蛋白反应，除硫化血红蛋白（SHb）外，其他血红蛋白都被高铁氰化钾转化成高铁血红蛋白（Hi），Hi再与氰离子反应生成HiCN，该物质有特征性吸收光谱，540nm处为最大吸收峰，在标准条件下，其吸光系数一定，用标准化的分光光度计测HiCN液的吸光度再换算成血红蛋白浓度（g/L）。
HiCN法必须待溶血和转换反应进行完全后才能进行测定，否则所得结果偏低。同时，测定前还要将HiCN溶液过滤，以除去颗粒杂质，并对所使用的分光光度计以HiCN标准液进行校正，这是测定的关键之一。目前所用的国际HiCN标准液按Holtz制定的方法制备，其浓度为550~850mg/L，保持清洁无菌,性质稳定，其吸收光谱特征符合国际HiCN参考品的要求。
3．红细胞比积（PCV）测定
红细胞比积的常规测定方法有离心法、稀释法、电阻抗法等，其中以离心法重现性较好(微量离心法测定红细胞比积的CV值为1%－2%)，但因残留血浆及其它因素的影响，特别是在病理情况下，其结果欠准确。ICSH曾于1980年推荐在Wintrobe管离心法的基础上用放射性核素标记的人白蛋白对残留血浆进行校正，并以此作为参考方法。该法是红细胞比积测定最准确的方法，但因其实验要求的特殊性，非普通实验室所能开展。
目前，ICSH制定了新的红细胞比积测定的参考方法[8]，即通过测定全血血红蛋白浓度与平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)，间接得到红细胞比积(Hb/MCHC法)。该方法的基本测定步骤是先将EDTAK或EDTAK抗凝的静脉血用硅酸硼制成的红细胞比积测定参考毛细管在一定条件下离心，离心后去血浆和上层压积红细胞，吸取压积红细胞的中央部分。因为残留血浆和白细胞多存在于压积红细胞的上层，且中央层的较下层的红细胞形态损伤小，中央层的压积红细胞血红蛋白浓度可视为MCHC。吸取的压积红细胞和全血都按ICSH所制定的参考方法测定血红蛋白浓度。因为MCHC=Hb/PCV，故PCV=Hb/MCHC，即得到红细胞比积。测定过程中吸取全血和压积红细胞应使用同一支标准化吸管，以避免吸管间差异所引起的误差，且对每一标本应同时作双份测定。Hb/MCHC法测定红细胞比积的CV值小于0.5%。
新的红细胞比积测定参考方法降低了实验要求，大多数血液实验室都能开展。但对于一般实验室红细胞比积测定结果的校正，用经过校正的毛细管(二级参考)作微量离心法即可。该参考方法主要在生产血细胞分析仪和微量离心管的过程中使用。
4．网织红细胞(RET)计数
目前网织红细胞计数的参考方法依然是目视计数法，即将血液标本作活体染色后制成血涂片，在显微镜下对红细胞逐个区分，计算出网织红细胞与红细胞总数的比值。再根据ICSH参考方法所计数的红细胞数，将网织红细胞相对数换算成每升血液中的绝对数。
网织红细胞计数所用染色液多为新亚甲蓝，染色液配置好后需过滤。并置棕色瓶中2－6℃一个月，用前过滤。为保证计数结果准确性，最好由两名技术员在同一个电视屏幕或双头显微镜下同时计数，对每一个标本计数三张血片。每次计数的红细胞数(n)、网织红细胞相对红细胞比值(p)及结果变异系数(CV)理论上有如下关系：n= (1－p)/p×(100/CV)2。由此可知，每次计数的红细胞越多，结果的变异系数就越小[10]。另外，在计数时，血涂片制作好坏对计数结果影响较大，薄血片至少长2.5cm，片尾长1cm，边缘平整，使用油镜前先用低倍镜寻找细胞分布均匀的区域，若发现有疟原虫，亨氏小体等干扰因素，该血片则不用于参考计数。
