HIV疫苗的实验室研究现状
张峰（综述）王佑春（审校） 中华医学实践杂志 2005 年 7 月 第 4 卷 第 7 期
人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）发现20余年间，已造成全球累计6000余万人感染，2000余万人死于AIDS（Acquired Immunodeficiency Syn-drome）。目前用于治疗HIV感染的药物只能控制病毒复制，不能彻底清除病毒，而且抗HIV药物价格昂贵，具有较严重的副作用，药物使用不当，也会诱发耐药株的产生。因此，研制安全、有效的疫苗是控制HIV传播的重要手段之一。目前国内外投入了大量资金开展HIV疫苗的研究，其中包括采用传统疫苗技术研制的减毒活疫苗和灭活疫苗以及采用现代生物技术研制的重组蛋白疫苗、DNA疫苗、病毒载体疫苗等，有些疫苗已完成了Ⅲ期临床研究，有些正在进行Ⅰ或Ⅱ期临床研究，但大部分仍处在实验室研究阶段。本文对HIV疫苗的实验室研究进展综述如下。
1 减毒活疫苗
到目前为止，进行过动物实验的免疫缺陷病毒疫苗中，减毒活疫苗的保护效果是最好的。早期对SIV的减毒集中于nef基因的部分或全部删除，Deniel等首先发现使用nef基因缺失的SIV减毒株免疫恒河猴，在随后1000倍恒河猴感染剂量的野毒株攻毒后，不能检测到感染 ［1］ 。减毒SIV疫苗还具有一定程度的交叉保护能力。但经过长期观察，SIV减毒活疫苗的安全问题也凸现了出来，使用nef基因缺失4个氨基酸的减毒株SIVmacC8免疫猕猴，免疫后17周，试验动物全部感染减毒株，并发展为AIDS样症状，分析病毒基因发现nef基因修复了12个核苷酸的缺失 ［2］。研究者删除vpr基因（SIVΔ2） ［3］ 使其减毒，但减毒后病毒复制能力下降，由于减毒株的复制能力与免疫反应强度正相关，因此删除U3区负调控元件，在保证病毒减毒程度不变的情况下以补偿减毒株的复制能力（SIVΔ3）。对用SIVΔnef和SIVΔ3免疫的猴子进行攻毒，以CD4 + T淋巴细胞数和病毒载量为指标，SIVΔ3的保护效果要好于SIVΔnef，但经过7年的观察，发现SIVΔ3仍具有恢复致病性的能力 ［4］ 。因此，HIV-1减毒活疫苗的安全性问题制约了它的发展，在没有解决之前，研究和优化其免疫效果价值不大。
2 灭活疫苗
Murphey-corb等使用福尔马林灭活的SIV病毒免疫9只猕猴，在10倍SID 50 （50%Simian Infectious Dose）剂量灭活病毒原始株攻毒中，全部免于感染。但当使用其它毒株攻击时，几乎没有保护效果，分析表明保护作用与抗体反应有关 ［5］ 。许多研究人员指出在以上实验中使用的灭活病毒和攻击病毒为在人T细胞中培养的SIV，保护作用可能与人源HLAⅠ类分子诱发的抗体有关 ［6］ 。Sutjipto等用猴源T细胞培养的SIV灭活疫苗进行免疫，对照组4只猕猴攻毒后3～9个月全部死亡，免疫组4只猕猴全部感染，到11个月观察终点为止也有一只死亡，但免疫组的病情进展比对照组明显减慢，这种情况与中和抗体有关 ［7］ 。使用灭活疫苗在HIV-1感染者中进行的早期人体试验也没有取得预防感染和控制病毒复制的效果，同时由于没有确证病毒灭活完全性的手段，难以保证不会发生由于病毒灭活不完全而导致感染的情况，灭活疫苗的研究受到了很大的限制。
3 蛋白疫苗
蛋白疫苗主要针对体液免疫反应，几乎所有的HIV蛋白疫苗都以HIV的膜区（env）gp160/gp120/gp41为原型衍化而来，这些蛋白疫苗所诱发的中和抗体具有很大的原始株特异性，实验中虽然能够较好地保护实验动物免受原始株感染，但是对异源毒株的攻击保护效果很差 ［8］ 。研究者对gp120/gp160进行删除可变区和糖基化位点突变的结构改造，希望能暴露更多保守的抗原表位，诱发广谱的中和抗体。对比野生型（Wt）与ΔV1～2、ΔV3、ΔV4和ΔV1～3改造的gp120 DH12 ，虽然都能诱发特异性抗体，对原始株中和活性最强的是Wt，其次是Δ4和Δ1～2，但对异源HIV都没有中和活性;Δ3和Δ1～3诱发的抗体没有任何中和活性 ［9］ 。gp120含有24个左右的糖基化位点，在三聚体中，寡糖链覆盖了大部分由高变区组成的表面。将SIVmac239gp120V1环上三个糖基化位点移除，感染动物血清表现出很高的针对SIVmac239的中和活性，对异源毒株SIVmac251和SIV E660，表现中度中和活性 ［10］ 。将对SIV改造成功的经验应用于HIV-1却没有获得预期的效果，在gp 120 DH1210个不同区域分别移除2～7个糖基化位点，免疫动物后对血清进行中和活性分析，结果表明突变gp120诱发的抗体在中和活性和中和谱系上都没有明显提高 ［11］ 。使用单体gp120/gp160诱发的抗体多为针对V3区和保守区，对天然三聚体结构刺突的亲和力却很低 ［12］ 。感染者血清中的抗体多为针对gp120的构像表位，它们表现出更好的反应性和中和活性 ［13］ 。将gp120/gp41切割位点突变，并删除gp41的胞内段和穿膜段形成gp140，使三聚体可溶性表达。使用三聚体gp140免疫小鼠，与单体gp140相比，虽然三聚体gp140诱发构像表位特异性抗体和gp41特异性抗体的能力更强，但没有发现三聚体gp140特异性的抗体，且这些抗体对原始株没有中和活性 ［14］ 。功能性研究发现，gp120-gp41切割位点的突变影响了gp140的结构，使三聚体gp140不能与CD4分子很好结合，也不能与CCR5结合。Vesanen等通过在gp120-gp41间形成分子间二硫键的形式来使切割后的gp120和gp41形成三聚体，改造后gp120-gp41反应原性比单体gp120和三聚体gp140的反应原性要好，它可以与2G12，2F5等中和性单抗很好的结合，并可以诱发具有中和活性的抗体，但是滴度不高 ［15］ ，没有明显的保护作用。
HIV膜区蛋白的结构非常复杂，既含有复杂的立体构像，中和性抗体多为构像依赖性抗体，又含有多糖基化位点，过多的糖基化可能会掩盖中和抗体位点的暴露，而且HIV自然感染机体后所诱导的中和抗体普遍较弱。这些现象提示单纯模仿HIV膜蛋白天然的抗原结构研制的疫苗将不会产生较强的而且广谱的中和抗体。因此，目前国际上研究的重点是根据HIV膜蛋白的基本特点设计新的免疫原，或对天然的膜蛋白进行改造，其目的是诱导机体产生广谱而且较强的中和抗体。
4 DNA疫苗
DNA疫苗进入细胞核内部表达所携带的外源基因，在诱发细胞免疫反应方面具有优势。HIV DNA疫苗研究中多采用包括多个病毒基因的方式来增加细胞免疫反应的强度和广泛性。如Kong等使用包含HIV-1A、B、C亚型env-gag-pol-nef基因的混合质粒免疫小鼠后，可诱发动物产生针对各个亚型相应蛋白的细胞免疫反应 ［16］ 。通过黏膜部位免疫，DNA疫苗还可用于诱发黏膜免疫反应。Fuller等使用gag-pol-env的DNA疫苗黏膜途径免疫猕猴，在异源SHIV-1黏膜攻击中，可保护4/7只猕猴免于感染 ［17］ 。HIV-1的密码子偏性很大，重组质粒在体内表达效率很低。在密码子优化的基础上，研究者使用MPL，QS-21，γ-CT等生物佐剂 ［18］ 或使用表达IL-2、IL-12、IFN-γ等细胞因子的质粒作为基因佐剂 ［19］ ，获得了增强的免疫效果。使用IL-2-Ig融合蛋白和CRL1005为佐剂的DNA疫苗，在SHIV89.6P的攻击中分别有7/8只和3/3只实验动物可以将病毒载量控制于检出限水平（500～1000拷贝/ml）以下。质粒DNA进入细胞核表达外源蛋白，能进行正确的翻译后加工并保持天然构像，在诱发体液免疫反应方面具有特殊优势。Bower等使用质粒在小鼠体内表达三聚体形式的env YU-2 ，可诱发较高滴度针对构像表位的中和抗体，能同时中和HIV-1 YU-2 和HIV-1 ADA 的体外感染 ［20］ 。
5 病毒载体疫苗
为了增加外源基因进入宿主体细胞的能力和表达效率，增加疫苗诱发的免疫反应强度，研究者发展了多种活病毒载体疫苗。其中最具代表性的是痘病毒（Vaccinia virus，VAC）载体。痘病毒类载体以其在诱发细胞免疫反应方面的优异性能，成为被众多研究者广泛采用的一类活病毒载 体。从安全性和免疫效果综合考虑，MVA为其中的佼佼者，MVA为Ankara株痘病毒在鸡胚细胞中经过570次传代，获得丢失六处共长达10kb基因片断限制了其宿主细胞谱系的减毒株 ［21］ 。不同于一些保留较强复制能力的痘病毒减毒株通过删除病毒的细胞因子（如IFN-γ）受体为减毒手段，并以宿主能产生足够强度的特异性免疫反应为前提来确保安全性。MVA在人体内复制水平很低，几乎检测不到，在欧洲对15万名健康人员进行的临床试验证明了其高度安全性，一度被研究者作为痘病毒类载体的金标准，用于衡量其它类型的痘病毒载体。即使在免疫缺陷的HIV-1感染者中，其安全性也得以保证。MVA多种途径接种放射线照射和抗T细胞抗体清除T淋巴细胞的猕猴，虽然在动物全身多个器官检出了MVA基因，但没有分离到活病毒颗粒 ［22］ 。同时，MVA可诱生IFN-γ，TNF-α等细胞因子，但它自身不表达IFN和TNF可溶性受体，从而可间接增强细胞免疫反应。使用rMVA-gag-pol-env89.6P免疫恒河猴，SHIV89.6P攻毒后，对照组动物出现明显的AIDS样症状，攻毒后168天半数死亡，免疫组动物表现出强的Gag-特异性细胞免疫反应和高滴度的中和抗体，到168天观察终点，CD4 + T淋巴细胞保持正常水平，病毒载量控制在检出限范围（500～1000拷贝/ml）以下，无1例出现AIDS样症状 ［23］ 。在诱发体液免疫反应方面，MVA要比DNA疫苗效果好，使用rMVA-env免疫恒河猴可以诱发中等滴度的中和抗体反应，免疫后3周抗体水平无下降，静脉攻毒后2周中和抗体有100倍升高，而对照组在攻毒后12周时中和抗体仍然检测不到或处于很低的水平 ［24］ 。除MVA外，研究者还构建了很多减毒的痘病毒载体，包括:NYVAC，AL-VAC，Fowlpox，Canarypox等。
除了痘病毒载体外，研究者还针对不同的需要和特点构建了许多其它的活病毒载体，如腺病毒载体、脊髓灰质炎病毒载体、水疱性口炎病毒载体、单纯疱疹病毒载体、委内瑞拉马脑炎病毒载体等。
6 DNA-病毒载体疫苗联合免疫
动物实验表明，已经存在的针对载体病毒的免疫反应能够严重影响免疫效果。以Prmie-Boost方式，使用携带gag-pol-env的DNA/rMVA和rMVA/rMVA同时免疫猕猴，rMVA/rMVA方式免疫的猕猴其CTL反应强度比DNA/rMVA方式低10倍 ［25］ 。以腺病毒作为载体的疫苗中，这种现象比MVA还要明显。使用DNA-活病毒载体疫苗，以Prime-Boost方式免疫，可以避免这种现象。已有许多实验性DNA-活病毒载体HIV疫苗在动物实验中取得了控制病毒复制的保护性结果。这些疫苗大多携带表达SIV gag-pol基因和HIV的env基因作为免疫原，并使用致病性的嵌合病毒SHIV作为攻击病毒，在末次免疫后的6周至7个月内经静脉和（或）黏膜途径攻毒。结果表明，虽然免疫组动物在攻毒后都建立了感染，但免疫系统在8～12周内将病毒载量控制在检出限水平（500～1000拷贝/ml），攻毒后2年内，超过90%的对照组动物经历CD4 + T淋巴细胞下降，AIDS样症状并死亡。而绝大部分免疫组动物仍可保持CD4 + T淋巴细胞于正常水平，也未出现AIDS样症状，对细胞免疫和体液免疫的功能性检测结果显示，病毒复制的控制应归功于HIV-1特异性的CD8 + T淋巴细胞的大量增殖和随后出现的中和抗体。
7 小结
目前研究者采用各种生物技术研制出了很多种类的HIV疫苗，部分也已进入了临床研究，但所有的临床研究结果均不理想，仍有许多问题需要解决，包括抗原片段的选择、载体的选择、免疫程序的优化等等，但最主要的问题是HIV疫苗的免疫指标与临床保护效果的关系不清楚，因此，只有在建立了与临床保护效果有关的免疫指标以后才能加速HIV疫苗的研究。
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作者单位:100050北京，中国药品生物制品检定所
