艾滋病检测质量管理工作指南(二)

范例：用蒸馏水称量标定移液器方法（参考芬兰Labsystems移液器标定方案）

在一室温为22℃的小型工作室（无风）中，在万分之一级别天平上放置一个小三角烧瓶，用待标定的移液器吸取蒸馏水（隔夜存放）加入小三角烧瓶内底部，每次称重后计量，去皮重后再加蒸馏水，连续加蒸馏水10次。加蒸馏水的量根据待标定的移液器不同规格而不同，见下表，移液器标定合格后，在移液器上贴上合格标签，标明日期。在移液器标定记录中填写移液器规格、编码、10次标定称量、标定日期和标定人签名。移液器10次标定称量在所要求的重量范围内为合格移液器：不合格移液器要根据移液器生产厂家所推荐的方法进行校准。

芬兰Labsystems移液器标定方案

（3）定期检查室内普通冰箱和孵育箱的温度并作好记录，- 20℃和- 70℃冰箱必须每天检查和记录。

（4）定期检查其他相关的仪器设备。

8.文件和文件管理

（1）建立标准操作程序文件（SOP）

SOP是书面质量体系中的一个很重要的部分。SOP是指导完成筛查（检测）工作的一整套书面操作指南，因而任何实验室应就本实验室所有重要工作制定相应的SOP。每一种检测项目都应该备有一份SOP，其中包含有详细的操作程序例如实验室实验条件（温度等）、仪器的使用和维护、试剂、质控品、校准品的使用等SOP （设备和试剂盒说明书作为附录），以避免或减少因不同的操作者所引起的误差。SOP由各岗位工作人员起萃，实验室负责人审定。实验人员在操作时应该严格按照SOP进行，实验室主管应该督查实验人员执行SOP。必要时，SOP中的内容如说明书或相关内容应该在实验室主管的领导下进行修订，每年至少修订一次。修订后的SOP按审批程序批准后使用。

SOP正规编写通常包括以下内容：

1）清楚、简洁的标题和统一的SOP编号

2）SOP编写和修改日期

3）编写和修订SOP的人员姓名

4）方法目的和原理

5）相应的职业规范

6）检测设备和试剂

7）参考其他包含相关步骤的SOP

8）健康和安全操作指南（参考传染性标本处理和废物安全处理SOP）

9）每一操作步骤和质控步骤用编号描述

10）结果的讨论和报告以及出现问题时所采取的措施

11）附录，包括相关的附加文件如标准表格、设备和试剂盒说明书等。

例1一般日常检测（60人次），应该考虑使用以下相应的SOP

（1）标本的接收和处理

（2）进行检测

（3）洗板器的使用

（4）读数仪的使用

（5）结果的报告

（6）阳性血样的追踪和处理

（7）实验室的清理和消毒

例2对特殊检测（>60人次），实验室SOP应该考虑包括以下附加内容

（1）待检标本的类型

（2）所有检测试剂的配制

（3）必要的核对和记录步骤

（4）检测前标本的处理

（5）试剂盒对照和外部对照标本的应用

（6）使用的检测设备

（7）应用的方法

（8）实验记录中检测数据的记录

（9）读取结果的方法

（10）初检阳性标本的复测

（11）最终结果的计算

（12）结果的使用

（13）下一检测工作的准备

（14）检测结束后的清洁处理

（2）建立实验原始记录表

每次实验前，应该根据本实验的要求，设计一份操作的原始记录表，在表中分别标明空白对照、阳性对照、阴性对照以及各待检样品的确切位置，以便于指导实验人员加样。要注明试剂盒来源、测定方法（包括反应时间和温度等）、批号、失效期；操作人员和复核人员姓名、操作日期。

（3）建立HIV抗体检测程序

见《规范》第3-6页。

（4）填写检测结果表

HIV抗体初筛阳性送检化验单和HIV抗体检测确认报告单见《规范》第16和17页。

（5）建立标本的登记记录

实验室收到标本后，有关参数应该及时登记在标本的登记记录中，包括受检者的姓名或代号、试管编号、性别、年龄、职业、送检单位、人群类别、检验结果（包括初筛、复检、确证）、送检日期、报告日期、备注（必要时记录通信地址）。

（6）建立HIV阳性标本的保存记录

记录中填写阳性标本血清/血浆的储存量、标本储存温度、标本储存起始时间以及标本保管人姓名。所有经确认的阳性标本，包括实验室留存的标本，应送省级HIV抗体确认中心或省级卫生行政部门指定的单位保存，不得擅自处理。

（7）建立实验室安全措施

参见《规范》附件一，第9页。

（8）文件存档

原始记录包括实验原始记录表、打印数据、膜反应条带或其照片、检测记录表、标本登记记录、标本保存记录以及仪器设备维修和校准记录等重要记录都应该妥善存档保存15年以上。推荐同时使用计算机保存各种文件和记录。内含病人姓名的所有工作记录一定要保密，参见《规范》第8页.

二.质量控制（QC）

（一）定义

质量控制是指为确保实验工作正常进行而在每一次实验过程中必须采取的各种措施。

质量控制也是实施实验室质量保证的一部分，它表明每一步操作产生可信的结果。质量控制具体内容是指将控制品（内部对照或外部对照）和检测标本一起实验操作，从控制值了解分析过程的质量情况。为便于观测和概括，又使用了一些统计学方法进行归纳和分析。质量控制的最终结果可以了解本次实验是否有效，所有试验条件是否正常，以及所有试验结果是否可靠。检测HIV抗体后能提供准确的检验报告，是每一个从事HIV抗体检验的实验室的最高宗旨。而为了达到这一目的，建立一个良好的质量控制程序是十分重要的。必须强调的是，实验室室内质量控制是室间质量评价（外部质量评价）的基础。

（二）实验室质量控制的基本要求

1.必须使用经卫生部批准或注册，经过中国药品生物制品检定所批批检定合格的国产或进口HIV抗体初筛和确认检测试剂。初筛用的HIV检测试剂必须是HIV一1/2混合型。在选用试剂时应优先选择经过临床评估质量优良的试剂盒。

2.必须使用在有效期内且保存条件符合要求的诊断试剂。

3.必须按照SOP中规定的要求进行操作，包括进行检测的实验条件如阳性对照和阴性对照的设置、试剂、标本加样量、孵育时间、反应温度、洗涤程序和次数等。

4.在实验前必须检查所有待检标本的质量，如有脂血、溶血或污染的标本原则上不能使用，必须重新采集标本。若无法重新采集标本，必须在室主管批准下使用，在检测结果中应该注明该份标本的情况。

5.冰冻的标本待全部融化后必须充分摇匀。

（三）质量控制

一般使用内部对照质控血清和外部对照质控血清来进行质量控制。在所有实验中必须包含有内部对照质控血清和外部对照质控血清，实验中的内部对照质控血清和外部对照质控血清的平均光密度值以及临界值可以监测批间操作的重复性。我们目前在HIV抗体检测的质量控制实验中所使用的外部对照质控血清为设置在临界值附近的弱阳性对照，如果弱阳性对照在临界值（Cut-off）附近出现波动，提示本次实验中有可能对光密度值（OD值或A值，下称OD值）在Cut-off值附近的未知标本作出错误的阳性或者阴性的判断。若弱阳性对照向负值偏移，可能导致出现一些假阴性，反之则可能出现假阳性。这是在HIV抗体检测中必须重视的现象。

1.内部对照质控血清

内部对照质控血清是指每个试剂盒内厂方提供的一套阴性和阳性对照血清。内部对照对每一次实验的质量控制措施来说是必要的，是质量控制的基础。每一次检测必须使用内部对照，而且内部对照只能在该批号生产的试剂盒中使用。

2.外部对照质控血清

外部对照质控血清是各级实验室为了监控每次检测的重复性和稳定性以及检验试剂盒批间差异而设置的一套阴性和阳性对照血清。设立外部对照还可以提示标本处于临界值状态时的检验操作情况。

（1）外部对照质控血清的组成

理想的外部对照应该包括阳性对照、弱阳性对照、临界值对照和阴性对照。但是目前各实验室应该在每次实验时设置一个单一浓度水平的质控品即弱阳性对照。这个弱阳性对照的值以设定在各试剂盒Cut-off值的2-3倍为宜。

（2）外部对照质控血清的来源和选择

1）通过向有关机构购买获得

2）通过实验室制备获得（比较经济的方法）

①混合试剂盒内部对照血清，等量分装。

②混合HIV抗体阳性或阴性人血清，3000转/分钟离心15分钟，用0.2μm生物滤膜过滤除菌后再进行56℃30分钟加热灭活处理。弱阳性对照可以通过使用HIV抗体阴性的正常人血清梯度稀释HIV抗体强阳性血清并经标定后得到。弱阳性对照的OD值以2-3倍于Cut-off为宜。

（3）外部对照质控血清的保存

1）外部对照血清或血浆的一次制备量应该足够为本实验室使用一年

2）外部对照血清应该均一、无菌

3）外部对照血清标定后应该等量分装，每个对照应该有足够的量供一周内实验用

4）外部对照应该分类作好标记，使用不同颜色的标签

5）外部对照血清应该存放在一70℃，如无条件则存放在非自动除霜的一20℃冰箱

6）外部对照血清一旦融解以后应该存放在2一8℃，一周后必须弃去，不能重新冻存。

（4）外部对照质控血清的使用

原则上每一次实验必须使用外部对照质控血清，建立质控图，以便监控实验操作的一次性和结果的准确性。同时，可以了解各批试剂盒之间的误差（批间差异）。

3.质量控制的统计学处理

（1）试剂盒内部对照质控血清范围和统计学处理按照各试剂盒说明书进行。

（2）外部对照质控血清的标定和统计学处理主要是根据确定可信限范围来确定外部对照值的允许范围，

l）建立质控图参数

对HIV抗体检测（ELISA）外部对照质控血清的评价采用多次测定的OD值的均值上下各两个标准差的范围，即外部对照OD值的95%可信限为x±2s。各个外部对照的标定即确定外部对照的均值和可信限可用几个统计学参数如均值（ ）、标准差(s)以及变异系数（cv）来确定可信限。

①算术平均值（ ）代表一组OD值数的平均值，为了统计学上有显著性意义，应该采用至少20次（天）所测得的外部对照质控血清OD值结果计算出平均值。

②标准差（s）是描述样本与均数之间离散程度的一个指标，是与对照值的均值有关的预期范围。一组OD值标准差以s代表。

③变异系数（cv），是反映各次OD值相对于均值的离散程度的一个指标，可以用于衡量被检标本检测的重复性或精密度。

计算公式为：

  = 

s计算公式为：

              s  = 

cv计算公式为：

cv  =  × 100 %

2）建立质量控制图和质量控制图的分析，见范例附图。

①质控图的定义

把检验性能数据与计算出的“控制线”进行比较的图。

②质控图的构成

质控图有一中心横线及其上、下各一或两条平行的控制线，并有按时间顺序填入的各质控血清测定的数值。

③质量图的制作方法

a.  在常规条件下，对同一批血清连续测定20次或20次以上，获得一组数据，求均数（ ）和标准差（s），参见上述计算公式，20个数据中超出2s或3s的数据不应删除。
b.  将均值（ ）和标准差（s）分别在质控框架图中标示出来。每个质控对照的吸光度值/Cut-off比值（S/CO，S为样品A值；CO为cut-off值）作纵座标（y轴），每一次（天）实验作横座标（x轴），建立质控图。
c.  从第21次起，每次检测的质控血清的结果依次点入该质控框架圈中，检验进入质控状态。见范例（范例为16次检测）。
d.  建议内部对照质控血清和外部对照质控血清的结果描绘在同一个质控图中，使整个质控结果一目了然。