我国开展滤纸片干血斑HIV抗体及核酸检测的研究现状

滤纸片是血液标本采集和运输的极好载体，应用全血滴在滤纸片上制成滤纸片干血斑，便于储存和运输，且有很好的生物稳定性，因此，特别适用于发展中国家边远地区的样本采集、贮存与运输。早在1973年，国外就开始研究用滤纸收集血样用于疾病的研究。近年来，国外不断有应用滤纸片干血斑来检测HIV-1抗体，检测HIV-1DNA及RNA的报道，但国内很少有这方面的系统性研究。我国是一个地域十分广阔的大国，有许多地处偏远的山区，鉴于此，为了在我国开展与推广这项技术，国家艾滋病参比实验室（NARL）从2004年开始，应用滤纸片干血斑检测HIV-1抗体、DNA、基因分型与病毒载量测定等方面的研究，并于2006年4月21～26日举办了第一次“全国滤纸片干血斑HIV-1DNA检测技术培训班”。

2004年国家艾滋病参比实验室首先研究了应用滤纸片片干血斑是否可替代血浆样本用于艾滋病抗体检测，实验评价了滤纸片样本的保存温度、存放时间对检测结果的影响，实验表明，不同温度（-20℃、2℃-8℃、15℃-30℃）和不同时间（24小时、3-5天、2周、1个月）条件下，滤纸片干血斑与血浆样本ELISA检测结果比较，p>0.05，尚不能认为时间、温度对ELISA实验结果（OD）值有影响。相同血样的滤纸片干血斑样本与血浆样本用EIA法检测，符合率为100%，相关性为0.919；两种样本经WB确认，条带完全一致的占总数的42.85%,其中主要条带（至少有2条env带出现，或至少1条env和p24带同时出现）的符合率为100%。其次，研究了应用滤纸片干血斑检测HIV-1前病毒DNA，用于诊断HIV-1感染的可行性。研究采集了59例静脉吸毒HIV-1感染者和22例HIV-1阴性健康人EDTA抗凝静脉全血5ml，保存全血1ml，另用50μl制备干血斑样本后，分离血浆。QIAamp Blood Mini 试剂盒和10% Chelex?100树脂分别提取全血和干血斑中细胞DNA。Roche? Cobas Amplicor RT-PCR方法检测HIV-1感染者血浆病毒载量。HIV-1Env基因Gp41区，gag基因，pol基因分别用2对外侧和内侧引物，按照套式PCR方法，进行扩增。以HIV-1任何两个基因区扩增结果组合判断HIV-1感染。结果发现， 在重复2-3次的前提下，59份DBS样本HIV-1 感染基因诊断敏感度93% (95%CI89%-97%)，34份全血样本94%(95%CI89%-98%)，χ2检验显示，两种样本用于HIV-1 基因诊断时无统计学显著性差异。22份两种阴性样本特异性均为100%（CI 95.93%--100%）。8份血浆VL>4.0LogDBS样本用于基因诊断的可重复性和HIV-1感染样本检出率优于5份VL<4.0Log样本。18对全血和DBS样本HIV-1基因诊断一致性分析，符合率94%。进一步又研究了应用滤纸片干血斑样本用于HIV-1基因序列测定和亚型分析，研究采集了20例静脉吸毒HIV-1感染者的EDTA抗凝静脉全血2ml， 50μl制备干血斑样本。QIAamp Blood Mini 试剂盒，10% Chelex?100树脂分别提取全血和干血斑中细胞DNA。HIV-1Env基因Gp41区2对外侧和内侧引物，按照套式PCR方法，扩增Gp41区，PCR产物用内侧正反向引物测序。MEGA3.0软件完成序列比对及亚型分析。结果发现， 18对符合要求的干血斑和全血样本进入研究。16对经序列分析归为中国流行的BC重组亚型，样本间的基因平均离散率为5.79%，与中国流行的BC重组亚型的基因离散率为4.91%，与C亚型代表序列基因离散率为8.89%，与其他几个国际亚型代表株的基因离散率在15%～20%之间。另两对样本分别归属于泰国B’亚型和欧美B亚型。由此可知，干血斑样本与全血样本DNA PCR产物亚型分析一致，氨基酸序列比对同义和非同义替换比例、位置和类型基本一致。

在上述研究的基础上，为了普及滤纸片干血斑技术在基层实验室的应用，NARL在天津疾病预防控制中心的协作下，于2006年4月16日～21日举办了“滤纸片干血斑HIV-1 DNA检测培训班”。为保证在实际操作过程中实验室的检测质量，国家艾滋病参比实验室制订了能力验证计划，计划包括制备能力验证盘并定期（每年两次：4月、10月）提供开展此工作的各实验室和对其检测结果进行评价。目前，全国已有15个实验室参加了技术培训，其中13个实验室参加并完成了国家艾滋病参比实验室的第一次能力验证活动。

同时，为了保证自身的检测质量，NARL参加了美国疾病预防控制中心的滤纸片干血斑能力验证项目，成绩均为优秀。(参比室 姚均)