微板法初步筛查批量标本Rh血型D抗原的检测方法
目前，Rh血型的筛查及鉴定基本上采用盐水法、酶法及聚凝胺等技术在试管中进行［1］，操作周期长，效率低，判定标准的人为因素影响多。随着多克隆(Polycolne)抗血清的生产以及微板技术的应用，出现了盐水介质抗血清一步法筛查Rh血型的微板操作技术。本中心于1999年4月建立了Rh血型大规模初筛的自动化操作方法，实现了Rh系统初筛的标准化，使也其成为本中心的常规检测项目。 1 材料方法 1.1 材料 无偿献血者血液标本(EDTANa2抗凝)；ML／ATplus2全自动样本处理系统(瑞士HAMILTON公司)；HTⅢ扫描酶标仪及TS温控孵育振荡器(奥地利ANTHOS公司)；T6000D平板离心机(美国SORVALL公司)；96孔硬质U形板(丹麦)；Medusa2000判读软件(英国SANGUIN公司)；博克隆(BioClone)抗-D血清(Monoclonal-Polyclonal Blend)及(Rh-hr Control)质控血清、标准试剂红细胞(美国强生公司)。 1.2 试验标本的选择 方法设计的原则是使D抗原性弱的标本尽可能以较强的凝集表现，故在其它试验条件确定之前，首先选择具有D抗原性较弱的标本，由于ORTHO公司的抗-D血清原液在使用时，除阴性和DU标本外，很难呈现弱凝集外观，因此需将血清倍比稀释，选择出现弱凝集效果的最低稀释度作为工作浓度：首先将抗血清按倍比稀释方法处理为：原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128等8个浓度，按照试剂要求分别用已知Rh阴性、阳性标本进行经典试管法定性试验，凝集效果为：Rh阴性标本的结果均是－；R阳性标本的结果依次为：4＋、4＋、2＋、1＋、1＋、＋／－、－、－。选用产生2＋效果的血清稀释度(1∶4)，用试管法从2000份已知阳性标本中筛出＋／－效果的标本7份，已知阴性标本2份，作为试验标本。 1.3 孵育条件 孵育是决定凝集效果的关键步骤，由于弱D抗原性标本的凝集效果较弱，为使其以较强的凝集表现出来，采用振荡器设置项进行4因素(41×33)水平的正交试验来确定孵育各个条件最佳组合，见表1。 表1 孵育条件各因素水平设置
| 抗血清浓度 | 振幅(level) | 振频(r/min) | 时间(min) |
| 1∶2 | 1 | 200 | 2 |
| 1∶4 | 2 | 400 | 4 |
| 1∶8 | 3 | 600 | 6 |
| 1∶16 |
2.1.1 孵育条件确定 各因素的优化确定参照正交试验的统计原理，经36个试验的数据积累，分别将各因素各水平OD值合计，对比选择最佳水平(图1～4）。由图1显示4个稀释度中1∶2的OD值最大，提示该浓度抗血清的实际效果最好，而1∶4的OD与1∶2近于持平，在考虑成本的前提下，决定采用1∶4的稀释度。图2则表现出OD值在最高水平时最大(4.07)，虽然比200(r/min)OD值(3.63)只高一点，依照正交试验原则，结果选定600(r／min)为最适振频。图3同样分析选择最佳振幅3 level。图4显示在4min时OD值最大，故选其为最佳时间。综合得出孵育最适条件：振频600r/min；振幅3 level；孵育时间4min。
图1 抗血清倍比稀释对比
图2 3水平振频对比
图3 3水平振幅对比
图4 3水平时间对比
2.1.2 悬浮条件确定 2min内阴性OD无明显差异，阳性结果凝集强度最大即为所选：1 level,900r/min(表2)。2.1.3 结果判断及Cut off值确定 根据所作1900多份已知D阳性标本和15份已知D阴性标本OD值分析选定Cut off值(表3)，并因此分别设定阳性(＋）Cut off值为1.000；阴性(—)Cut off值为0.300，可疑范围为0.301～1.000，需进一步重复试验。
表2 悬浮条件各水平间OD值比较
| 振频(r/min) | 振幅1(1 level) | 振幅2(3 level) |
| 900 | 4.04 | 2.96 |
| 1000 | 3.53 | 2.5 |
表3 阴性标本与阳性标本OD值分布
| 阳性 | 阴性 | ||
| n | OD | n | OD |
| 1899 | 4.500～3.000 | 6 | 0.022～0.100 |
| 23 | 2.999～2.000 | 5 | 0.101～0.199 |
| 5 | 1.999～1.000 | 3 | 0.200～0.298 |
| 1 | 0.301 |
2.2.1 正确性 采用本方法筛查无偿献血标本近3万人份，所得阴性标本140份均进行经典试管法验证试验，与微板法的符合率为98.6%(138／140）。采用ORTHO公司Bio vue卡(抗-IgG,-C3d)作AHG试验，结果阴性124份，阳性16份。
2.2.2 灵敏度及凝集强度 采用试管法获得1＋，＋／－外观的标本(因标本来源困难，对比试验仍使用优化试验所选的弱抗原标本)，微板法OD值＞3.000，肉眼观察均可达到＞3＋结果，而且细胞凝块集中，易于观察。应用本方法对2万多人份D阳性标本进行凝集效果观察，OD值在4.500～3.000的占98.55%，在2.999～2.000的占1.19%，1.999～1.000的只有0.26%。
3 讨论现行Rh血型鉴定技术基本都属于试管操作，均存在检测步骤繁琐、试验周期长的缺点，而且结果判读标准难于统一，有争议的试验外观还需凭经验下结论。虽然有些判读方法如“溪流法”、“振荡法”也被引入微板操作，但仍需肉眼判断［1］，人为干扰因素过多。近年来不断有人对传统方法加以改进，提高试验效率和准确性，如采用单克隆IgM和单克隆IgG的抗-D试剂两步法筛查Rh血型［2］；将抗球蛋白血清用10% γ-球蛋白包被于微板的固相化技术筛查Rh因子［4］。20世纪80年代初开发了全自动血型检测系统，其标准化的操作程序可以准确地检测出特殊血型，但因其成本太高和功能局限，一般单位不易承受。为解决此类问题，笔者利用本中心的全自动血液样本处理系统和具有扫描功能的酶标仪，对大批量无偿献血者标本进行Rh阴性血型初筛，实行了检测过程程序化；判读标准化，结果数据化。有效地排除了人为干扰，处理96人份标本只需25min，大大提高了工作效率。目前，国内许多采供血机构已购买了自动血液样本处理系统，如果借鉴本法则可提高进口设备的利用率，更好地发挥作用。本法技术要点在于：使用敏感的自动化设备作献血者的检测采用单克隆和多克隆抗-D试剂并行的手段，以保证弱D抗原的有效检出［3］；使用统一的操作程序，要求有效价高、批间稳定的标准化试剂，选用可用于微板法试验的多克隆的标准血清，其成分包含单克隆IgM和多克隆IgG，涵盖范围广泛，对D抗原和部分弱D抗原(DU）均可产生较好的凝集反应。对其工作浓度进行优化，使其在适当稀释度下对较弱抗原产生良好的凝集效果，而其成本只折合人民币0.18元／人份，国内多数血站均可承受。其次，在产生凝集反应的孵育环节，采用了(41×33）的多因素多水平设置进行优化，确定出相互影响的各因素之间的最适水平搭配。各因素、水平的选择是依照现有孵育振荡器的功能设置而定，这样可使操作程序标准化，利于监控，避免人为干扰。作为大批量标本的常规初步筛查，目的在于及时检出可能的Rh阴性献血者，及时保留和利用稀有血液，为排除假阴性，还要对所有阴性反应标本进行了重复试验，并排除DU，而弱阳结果先按一般阳性报结果，不考虑假阳性问题。筛查所得结果以数据形式保存，并由网络进行信息传输，保证了结果的可靠性和完整性。通过对以上要点严格控制，提高了筛查效率和精确性，本法与经典试管法对比，阴性结果符合率98.6%，与国外资料显示同类组合式检测系统的使用准确率［5］相同。基本上杜绝假阴性的错报。
在此基础上，笔者将进一步制定筛查程序的标准化操作规程(SOP)，并准备加入Rh系统的质控监测，以保证筛查质量。
参考文献1，吕 鹏主编.最新输血技术学.北京：人民卫生出版社，1994，395～397
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