13例输血后TTV动态观察

自1997年10月Nishizaw等^［1］发表第1篇关于TTV的论文以来，许多国家开展了TTV的研究，我国北京^［2］、深圳^［3］等地也做了大量工作，但对于TTV的致病性，特别是输入TTV阳性血后临床上改变的调查较少。为了进一步阐明TTV的致病性，笔者对13名输入TTV感染血的患者进行了3个月动态观察，现将结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 研究对象 1999年1月，选择产科2例，外科10例，内科1例，其中男性10名，女性3名，年龄31～77岁。输血前后对以上患者进行肝功能和TTV DNA测定，对其中1例TTV DNA阳性者进行分子克隆和部分核苷酸序列分析。 1.2 标本收集 采用经灭菌处理一次性带盖试管，对输血后患者空腹静脉抽血10ml，离心分离血清，分装后－20℃保存备用；输完血后取输血袋，血浆分装后－20℃保存，并进行TTV DNA的测定，发现献血阳性者，分期随访患者。 1.3 检测材料 HAV-IgM、HBVM、抗-HCV、HDVAg、HDVAb、抗-HEV免疫试剂购于广州中山公司，抗-HGV酶联免疫试剂由302医院提供，肝功能检测采用美国ASCATM全自动生化分析仪。ALT、AST、TP、Alb、TBiL、DBiL、γ-GT液体型生化试剂由上海复旦张江生物医药公司提供，套式PCR试剂盒由北京军区总医院提供。 1.4 引物合成 根据Okmato等报道TTV基因序列^［4］，采用Goldkey软件在TTV ORF保守区设计两对套式引物，引物序列如下：T1:5’-AC AG AC AG AG GA GA AG GC AA C-3’；T2：5’-G GA TA CC TA TT AG CT CT CA T-3’；T3：5’-AA CA TG TT GT GG AT AG AC TG G-3’；T4：5’-CC TG GC AT TT TA CC AT TT CCA ^3’其中T1、T2为外引物，T3、T4为内引物，扩增产物长272bp。 1.5 TTV DNA的检测 ①裂解：血清50μl，加裂解液150μl混匀，94℃10min。②分离：在裂解混合液内，每反应体系加入氯仿／异丙醇及饱合酚，震摇试管10s，混匀。在台式离心机上10000r/min离心，室温10min收集水相沉淀。③沉淀：异丙醇200μl，立即加已含DNA水相试管内，-20℃30～60min；离心：12000r/min离心，室温15min，用微量真空泵吸取上清及管边水珠。④第1次PCR：每反应体系加入第1次PCR反应混合液50μl悬浮沉淀，液体石蜡封顶，预变性94℃30s，94℃30s，55℃45s，72℃45s，35次循环，⑤取每反应体系，加第2次PCR反应混合液45μl，混匀分别取第1次PCR产物5μl，加入45μl反应混合液中，液体石蜡油封顶，预变性94℃30s，94℃30s，55℃45s，72℃45s，35次循环。⑥产物检测：用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳或2%琼脂电泳检测，溴化乙锭染色，在紫外检测仪上观察结果，设阴、阳性对照。 1.6 PCR产物的分子克隆与测序 取第2次PCR产物，经酚／氯仿抽取，乙醇沉淀纯化后，直接于T载体连接，转入XLT-Blus宿主菌，挑取白色菌落，用PCR鉴定，对阳性菌落接种培养，提取质粒，采用OPEN GENE型自动测序仪，进行DNA测序。 2 结果