医学检验信息网 检验医学 2007-1-31 12:16:42

1.4 PCR-SSP测定方法 每个PCR扩增体系为40μl，其中包括基因组DNA200ng，10×PCR缓冲液(10mmol/LTris-HCl,pH8.3,50mmol/L KCl ,0.001%明胶), 2.5mmol/L MgCl₂,375mmol/L dNTP,特异性引物各1.0mmol/L，内对照引物各0.2mmol/L,1.25U TaqDNA酶(美国Perkin-Elmer美国)；扩增采用Mastercycler 5330自动循环仪(德国Eppendorf公司)，首先，94℃10min,接着94℃1min，67℃2min(HPA-2、4系统，65℃2min)、72℃1min循环30次，最后72℃延伸10min。 1.5 扩增产物的检测 取扩增后产物10μl在2％琼脂糖凝胶(含溴乙锭0.5μg/ml)中电泳，约30min后在紫外仪上观察电泳条带，以宝丽来快照记录结果。 1.6 PCR-ASO 按试剂盒说明书操作，通过ELISA方法进行结果检测。 2 结果 2.1 PCR-SSP方法分型 25名健康献血者的HPA-1～4系统PCR-SSP分型结果见表2及附图。 表2 25名献血者的HPA-1～4系统PCR-SSP分型结果^*

基因型	HPA-1	HPA-2	HPA-3	HPA-4
a＋b－	24	23	10	24
a＋b＋	1	2	13	1
a－b＋	0	0	2	0
合计	25	25	25	25

 *与PCQ-ASO分型结果完全一致 M:100bp ladder DNA;*为内对照产物；**为特异扩增产物 附图 HPA-1～4PCR-SSP方法基因分型的电泳结果 2.2 PCR-ASO方法分型 25名健康献血者的HPA-1～4系统PCR-ASO分型结果与PCR-SSP分型结果完全一致。 3 讨论

随着成分输血的深入开展，对HPA分型的需求在日益增长。血清学方法，如混合被动血凝试验(MPHA)、血小板抗原单克隆特异性抗体固定试验(MAIPA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)^［4］以及简易致敏红细胞血小板血清学试验(SEPSA)^［6］等于血小板抗体的检测固然比较简便，但用于HPA定型则有其不足之处：如血小板抗体血清很难获得，尤其是抗2a和抗3b血清，而且在一些PTP或PTR病人中较难获得足够的血小板用于血清学试验。近来开始出现的DNA分型方法则克服了这些不足，它不需要血小板抗体和新鲜的血小板，只需要少量的全血或组织便可作HPA基因型分型^［4］ 。应用于HPA基因型分型的分子生物学方法主要有以下几种：PCR-ASO^［7～9］ 、限制性片断长度多态性分析(RFLP)^［5］ 、PCR-SSP等。PCR-ASO方法比较繁琐,且判断试验结果不太容易。RFLP方法较PCR-ASO方法简单，但由于其需要限制性内切酶的使用和消化步骤，故仍然较为繁琐，且无法对HPA-4系统作基因型分型^［4］ 。PCR-SSP方法允许PCR扩增后，直接凝胶电泳，进行结果判断，所以较前二种方法简单、快速和经济。Tanaka等^［4］使用PCR-SSP方法对HPA-2～4系统作了基因型分型，而Klüter等^［10］对HPA-1～3，5系统进行了分型。笔者亦尝试以PCR-SSP方法对HPA-1～4这 4个比较重要的HPA系统进行基因分型。通过对PCR中各个反应成分（尤其是MgCl₂浓度）及反应循环条件（尤其是退火温度和时间）的选定，增加反应的特异性，减少非特异性扩增，逐个系统进行研究，最终建立了HPA-1～ 4系统的PCR-SSP基因分型方法，且PCR-SSP分型的结果与采用PCR-ASO方法获得的结果完全一致。

本实验研究结果说明，使用PCR-SSP方法对HPA进行基因分型具有简单、快速、经济、准确等优点，故其应用前景广阔，如能给NAITP、PTP和PTR 患者以及一些血小板单采献血者作HPA定型，使血小板配合型输血成为可能，从而提高血小板输注的安全性及有效性。另外还可以对大规模人群进行HPA基因频率的调查，有助于进行人类学的研究。当然，还能对孕妇进行筛选，对新生儿同种免疫血小板减少性紫癜的风险作出正确的估计。

参考文献

1，Kunicki TJ, Furihata K, Bull B, et al. The immunogenicity of platelet membrane glycoproteins. Transfusion Med Rev， 1987，1:21

2，Newman PJ. Nomenclature of human platelet alloantigens: aproblem with the HPA system? Blood， 1994，83:1447

3，Tomiyama Y, Take H, Ikeda H,et al. Identification of the platelet-specific alloantigen , Nak^a, on platelet membrane glycoprotein Ⅳ. Blood， 1990，75:684

4，Tanaka S, Taniue A, Nagao N,et al. Simultaneous DNA typing of human platelet antigens 2,3 and 4 by an allele-specific PCR method. Vox Sang， 1995，68:225

5，Skogen B, Bellissimo DB, Hessner MJ, et al. Rapid determination of platelet alloantigen genotypes by polymerase chain reaction using allele-specific primers. Transfusion ，1994，34:955

6，刘达庄，包于勤，陆 萍，等．简易致敏红细胞血小板血清学技术的研究和应用．中华血液学杂志，1993，14：642

7，McFarland JG, Aster RH, Bussel JB,et al. Prenatal diagnosis of neonatal alloimmune thrombocytopenia using allele-specific oligonucleotide probes. Blood ，1991，78:2276

8，Lyman S, Aster RH, Visentin GP,et al. Polymorphism of human platelet membrane glycoprotein Ⅱ_b associated with the Bak^a/Bak^b alloantigen system. Blood ，1990，75:2343

9，Wang R, Furihata K, McFarland JG,et al. An amino acid polymorphism within the RGD binding domain of platelet membrane glycoprotein Ⅲa is responsible for the formation of the Pen^a/Pen^b alloantigen system. J Clin Invest ，1992，90:2038

10，Klü ter H, Fehlau K, Panzer S,et al. Rapid typing for human platelet antigen system-1,-2,-3 and-5 by PCR amplification with sequence-specific primers. Vox Sang， 1996，71:121

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