HBV拉米夫定耐药检测研究进展
医学检验信息网
检验医学
2006-12-1 12:43:05
* 欧志英1,2 综述， 何蕴韶1,2 王伟毅1 审校
（1中山大学达安基因诊断中心，广州 510080； 2中山大学解剖学教研室，广州 510080）
[摘要] HBV是严重危害人类健康的重要的病毒性致病因子之一，HBV感染后可导致慢乙肝、肝硬化甚至肝癌。我国是慢性乙型肝炎的高发区，拉米夫定是目前普遍使用的治疗慢性乙肝的核苷类似药物，但用药后易引起HBV基因组突变而使HBV产生耐药性，降低治疗的效果，临床上很有必要对病者的HBV基因组进行检测以及用药过程中的监测。本文综述了近年来乙型肝炎病毒基因组耐药突变检测方法及其临床意义，为临床拉米夫定耐药突变的核酸检测和治疗由HBV感染引起的肝脏疾病提供参考。
[关键词] HBV；拉米夫定；耐药；核酸检测
Progress on HBV Lamivudine Resistance Mutants Detection
OU Zhi-Ying1,2 He Yun-Shao1,2 Wang Wei-Yi1
(1DaAn Gene Diagnostic Center, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, China）
(2 Department of Human Anatomy, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China)
Abatract: Hepatitis B virus (HBV) is the most common infectious virus that affects people all over the world; it may stimulate chronic hepatitis, liver cirrhosis and even hepatocellular carcinomia. There is a high incidence of chronic hepatitis B virus infection in China, lamivudine is the most commonly used nucleotide analogy to treat chronic hepatitis B, but will induce mutations in HBV genome and cause drug resistant. It’s very important to detect the HBV lamivudine resistant mutation. We reviewed the significance of HBV lamivudine resistance mutation detection and several current methods for HBV lamivudine drug resistance mutation detection with their clinical applications. Our review will give some help on detection of lamivudine resistant mutation and treatment of chronic HBV infection.
Key words: HBV； lamivudine； drug resistance； Nuclear diagnose
乙型肝炎（Hepatitis B）是由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）引起的一种危害极为严重的传染病。HBV是重要的肝脏疾病致病因子，主要通过性接触和血液传播，也可通过医源性、胎源性、昆虫叮咬或与HBV携带者生活密切接触传播。世界上有20亿人感染HBV，约占全球人口的1/3。目前全世界慢性HBV感染患者至少有3.5亿，其中HBV携带者75%分布在东南亚和次撒哈拉地区，而我国就占了1.2亿。估计全球每年有100～200万人直接死于HBV持续感染[1，2]。慢性乙型肝炎病毒感染者中50%～75%有活跃的病毒复制和肝脏炎症，感染的自然病程漫长，可持续30～50年, 表现为易于慢性化的特征。持续慢性HBV感染在临床上可表现为各种不同类型的疾病，包括无症状携带状态，急、慢性肝炎，重症肝炎，肝纤维化和肝硬化等，有的还可能发展为原发性肝癌（HCC）。
1 HBV基因组的生物学特点
HBV是DNA病毒，基因组全长约3.2 Kb，为独特的带有部分单链区的环状双链模式。基因组简单、高度压缩、重复利用。HBV基因组共含有4个转录单元，每个转录单元构成一个独立的开放读码框（Open Reading Fram，ORF），由于4个转录单元之间相互重叠，其ORF总长为4.7 Kb。HBV的4个ORF（图1,表1）分别为P、X、C、S，其中S ORF长度为1 185 bp，由S、Pre-S1和Pre-S2三个区域组成，各个区都有自己的起始密码ATG，但三个区共同合用5￠ 端的终止密码子。S ORF编码含有226 个氨基酸的包膜主要表面蛋白，又称小表面蛋白或表面抗原，即HBsAg，构成了HBV的抗原特性，是HBV疫苗开发的耙点。C ORF的长度为639 bp，编码HBcAg和HBeAg，HBcAg是免疫攻击的靶抗原，X ORF长465 bp，编码155个氨基酸的X蛋白，是参与细胞凋亡的反式激活蛋白。P ORF长2 532 bp，编码844个氨基酸的P蛋白(即HBV DNA多聚酶)，是病毒复制的主要功能单位，也是抗病毒药物开发的主要靶标。P ORF包括括4个编码区域[3，4]，从氨基端开始分别为：①末端蛋白区(TP)，末端蛋白在逆转录过程中与负链DNA结合。②间隔区(SD)，该区具有耐受突变，缺失并不影响聚合酶的活性。③逆转录酶区（RT），该区包含5个功能保守序列A-E：A区（AA421-436），B区（AA506-528），C区（AA546-550），D区（AA576-589），E区（AA592-600），是维持反转录酶活性所必须，其中A、C、D区为酶与三磷酸核苷结合的结合域，B、E区为RNA模板和引物定位域。目前临床应用的核苷类似药物主要靶点位于逆转录酶RT区的B及C区，HBV多聚酶的催化域是位于C区的YMDD基序。HBV基因型不同，保守区氨基酸位点不一样，该蛋白同时具有依赖RNA的RNA聚合酶活性(RdRP)和依赖RNA的DNA聚合酶活性，即同时有逆转录酶和DNA聚合酶的活性，能将前基因组RNA反转录成负链DNA，并以此负链DNA为模板合成正链DNA。④RNase H区。
2 HBV的耐药性
HBV多聚酶的催化结构在自然条件下很少发生变异,但在长期药物治疗后则极易发生变异，产生耐药性，如临床常见的免疫球蛋白耐药、拉米夫定耐药、更昔洛韦耐药等。耐药后，抑制病毒复制的能力下降，患者血清HBV DNA反弹。各种耐药突变在基因组中核苷酸突变位点不同(表2)。
随着现代医学治疗技术的进步，准确了解某个病人体内病毒的复制状态需要详细的病毒血清学和分子生物学信息，这些信息有助于选择正确的临床管理和治疗方案。HBV耐药核酸检测在临床上能为慢性HBV感染病人治疗方案的选择和调整提供个性化的、关键的分子病毒学信息。
3 HBV拉米夫定耐药突变检测及其临床意义
目前治疗慢性乙肝主要用干扰素或核苷类似物，如拉米夫定、更昔洛韦等，干扰HBV复制来达到治疗的目的[5，6]。拉米夫定（Lamivudine，3TC or Epivir)，中文名贺普汀，是口服胞核嘧啶核苷类似物，由葛兰素史克公司在1992年研发成功并生产，1998年进入中国并被批准用于临床，拉米夫定服用方便、不良反应少，易为患者接受，是目前公认的最有效而安全的抑制病毒复制的核苷类似药物，该药的出现使抗HBV治疗发生了质的飞跃，使不适宜用α-干扰素治疗或治疗无应答病人有了新的治疗选择。
HBV基因组复制要通过逆转录机制才能进行，首先形成RNA复制中间体，而RNA复制中间体的形成需要逆转录酶的作用才得以进行，但该酶缺乏校对功能，逆转录过程中容易发生错配导致基因突变，在HBV基因组中逆转录聚合酶的催化结合部位有一个高度保守的YMDD基序，即酪氨酸-甲硫氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸[7]，拉米夫定能够与其特异性结合，通过抑制前基因组RNA逆转录为负链DNA及终止DNA链延伸而有效地抑制HBV DNA复制[8]，拉米夫定的作用机理是在细胞内转化成活性代谢成分拉米夫定-5￠-三磷酸，它可作为一个链终止子或竞争自然底物dCTP，抑制病毒RNA依赖的DNA聚合酶(逆转录酶)的活性[9]。治疗慢性乙肝的临床试验表明：拉米夫定用药后血清病毒滴度明显减少，有的低至检测不出的水平，丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性迅速降低，血清肝酶活性正常化，肝组织病理改善，HBeAg血清转化成HBeAb，病情稳定，阻止肝纤维化进展[8，10，11]，因此是疗效较好的抗HBV药物。拉米夫定对HBV cccDNA(Covalently Closed Circular HBV DNA,共价闭合环状HBV DNA)无直接作用，短期治疗不能完全清除体内HBV cccDNA[12]，大多数病人需要长期的抗病毒治疗以期耗竭cccDNA库来达到清除HBV的目的。但是长期单一使用拉米夫定治疗后，病毒在药物和人体免疫选择压力下可能产生耐药性，出现一些与以往的药物治疗慢性乙型肝炎类似的问题，例如持续应答率不满意、部分患者停药后复发、需长期用药且出现耐药变异等[13]。拉米夫定耐药突变在用药后6个月开始出现，呈现为逐年用药递增[10，11]，用药1年时有16%-32%患者发生耐药变异，2年时为47%-56%，3年时达69%-75%[14]。YMDD基序是聚合酶活性所必需的，是HBV逆转录酶的高保守区，变异后的HBV对拉米夫定的敏感性下降，从而导致治疗失败，甚至导致病情恶化[15]。如果耐药突变发生后继续用药，不仅增加病人不必要的经济负担和造成社会资源的浪费[16]，还可能存在严重的流行病学危害[17]。de Man等[18]报道1例肝移植手术后HBV感染患者，乙型肝炎免疫球蛋白治疗导致HBsAg逃避变异株，用泛昔洛韦治疗6个月(500 mg， 3次/d)无效，P基因测序发现第513位氨基酸有异亮氨酸→亮氨酸的突变，后改用拉米夫定治疗（100 mg， 1次/d），HBV DNA水平骤降，但拉米夫定治疗12个月后HBV DNA反弹，且发生重症肝炎，最后死亡。测序发现在YMDD区域附近有突变，因此在出现YMDD变异株后很有必要密切监视患者病情变化，包括肝脏功能、HBV DNA定量等。如出现ALT明显升高，临床症状加重，则应立即停药，临床上检测YMDD基序变异对时调整治疗方案、合理用药及提高疗效具有重要的指导意义。
拉米夫定耐药性的产生主要是由病毒基因组变化引起的。近年来报道了拉米夫定治疗乙肝过程中产生的耐药突变主要集中在552位氨基酸的YMDD→YIDD/YVDD，即在HBV YMDD基序区发生碱基替代G743T或A741G，即Atg→Att/Gtg。Locarnini等报道认为M552V 是拉米夫定耐药突变的主要形式，有趣的是有些耐药突变中除了这些碱基突变还常伴有其他碱基突变，如M552V突变总伴随着P基因B区的L528M突变，两种突变同时存在可能与M552V和M552I 耐药性强弱有关[19，20]。动物实验表明各种突变耐药的强弱顺序为：M552 I ＞L528M +M552V＞M552V＞L528M[16]，目前有人建议将这些突变分为Ⅰ组(M552V/L528M)和Ⅱ组(M552I)[16]。其他类型的拉米夫定耐药突变还包括拉米夫定治疗中产生的F512L、V519L和V555I突变，及与Famciclovir耐药相关的L528M、V519L和V555I突变[13，21]。这些突变并不是病毒耐药突变的主要形式，其出现有时可导致病毒复制反弹，HBV DNA及ALT水平升高[22]，所以，在临床上用拉米夫定治疗乙肝的同时要监测病人血清有无耐药性的变化,降低疾病的严重复发。
随着拉米夫定耐药株的出现，国内外研究者都在积极寻找有效的检测方法。目前耐药突变的检测方法主要有以下几种：质谱分析[23]，荧光偏振[24]，PCR-肽核酸[25]，限制性片段长度多态方法RFLP[26]，线性探针分析法LiPA[27]，荧光定量PCR熔解曲线分析法[28]，基因芯片技术[29]。这些方法大多成本昂贵，对技术和设备要求很高或者操作繁琐，耗时费力，不利于广大基层医院开展应用，仍需进一步研究。基因芯片技术目前尚未成熟，芯片制作成本高，临床无法普及。目前临床用得最多的是RFLP，RFLP在HBV耐药检测方面主要检测的是单一类型的感染，对混合型耐药株感染显得束手无策。LiPA和与其原理相似的反向斑点杂交方法（Reverse Dot Blot,RDB）可能是今后临床HBV耐药株检测的主要方法，这类方法最大的优点是一次可以检测多个位点，操作简单，成本低廉。RDB是一种简单的检测基因组突变的有效方法，已经成功地在地中海贫血基因突变检测中应用，可以有效地区分单碱基突变。
中山大学达安基因诊断中心开发出的HBV拉米夫定耐药突变RDB检测试剂盒具有方法灵敏、简便、快捷的特点，能很好地区分HBV野生型YMDD及其变异类型YIDD和YVDD。即能检测单一感染，又能检测混合感染或突变，而且还能根据杂交点颜色的深浅判定病毒裁量达到定量检测突变型病毒的目的，有很好的临床应用价值。该试剂盒主要检测野生型（YMDD）和突变型（YIDD和YVDD），HBV拉米夫定耐药的临床分型检测包括的过程有：血清的获得；血清DNA的提取；YMDD片段的PCR扩增；PCR扩增产物的杂交4个步骤（详见试剂盒说明书）。该试剂盒除设计了各型所对应的特异性探针外，另设计了显色对照探针及野生型和突变型的的阳性标准品，具有完备的质量控制体系；同时配备凯普HHM-2型医用核酸分子快速杂交仪，该杂交仪的设计采用了独特的导流杂交原理，大大增加了核酸分子的扩散率和局部反应的浓度，显著提高了核酸杂交效率，从样本处理到结果判读最快仅需3小时，和传统的杂交相比，其杂交过程具有操作简单、快速（熟练只需40分钟）。由于核酸探针设计的严密性和科学性，拉米夫定耐药HBV检测灵敏度、特异性好，非常适用于临床标本的快速检测和大样本的普查（一次可检测15人份或更多样本）。用该试剂检测结果出现混合感染或者变异株占优势，可决定临床是否再继续使用拉米夫定或停药改用其他药物，新近开发的一些核苷类似药物如阿的福韦，对YMDD变异株仍然有效，将来上市后可以作为治疗这种变异株的有效药物。
要监测耐药性的变化，分析的重点应在P基因的B区和C区。YMDD基序是聚合酶活性所必需的，是所有逆转录酶的高保守区，同时，YMDD基序的聚合酶基因(P基因，即HBV的P区)有足够的变异，能区分HBV的不同基因型，Kato等[30]根据P基因序列对HBV进行了分型分析，分型的结果与已发表的结果进行比较证实了方法的正确性。 Rod?yguez-Nóvoa等[22]针对P基因选择了一段包含YMDD基序，即拉米夫定耐药区段的一短片段序列设计了一种快速、可靠的检测方法，该方法既能检测拉米夫定耐药突变，又能对病毒基因进行基因分型，作者从每一个基因型中选择了一个有代表性的序列(通用序列)进行簇分析，这样基因分型区也是拉米夫定耐药突变区，从同一项检测既可获得病人病毒基因分型的分子信息，也可得到病人病毒拉米夫定耐药性的分子病毒学资料，简少了检测的复杂性，为乙肝病人治疗提供更丰富、可靠的临床分子诊断证据。
HBV基因组的碱基替代突变频率是人类基因组碱基突变频率的104倍[31]。目前有关的病毒变异特点及其临床重要性的数据越来越多[2]，其中最重要的一个是Pre-C基因突变[2]。Pre-C区突变病人的持续病毒血症(Viremia)常伴有进行性肝脏疾病，包括肝硬化和肝癌。HBeAg状态的分子基础目前已很清楚，可能是Pre-C区启动子突变引起或是由HBeAg编码区的突变引起。有趣的是，致HBeAg阴性的突变和病毒的系统分型突变之间有一定的关联。临床上突变的生物学特性很重要，因为虽然用拉米夫定对HBeAg阴性病人治疗的反应与对HBeAg阳性慢性HBV病人治疗相似，但有分子证据表明有些Pre-C突变可能导致对IFN-alpha 耐药性更强[32]，有些突变能进一步导致肝脏疾病，而有些突变可能导致病毒致病性丧失[33]。肝移植或普遍使用预防疫苗人群的HBV临床耐药性用HBV免疫球蛋白(HBIg)也能观测到，这种情况下，突变主要发生在大多数中立的抗原决定基----HBsAg的a抗原决定簇[34]。目前在大面积注射乙肝疫苗的地区广泛使用拉米夫定，这样，HBsAg和P基因双突变可能是一个重要而有意义的临床问题，另外有更多的数据表明HBsAg阴性的病人占了不明病因肝炎的重要比例，但用传统的HBsAg血清学分析方法根本检测不出[2]。所以我们有必要进一步研究更加特异、敏感、快速、简单、廉价的HBV耐药检测方法。
4 总结与展望
HBV感染的临床治疗不能仅限于野生型病毒。详细的病人病毒类型的分子信息显然是很重要的,也是临床个体化治疗实现的基础。临床实践中选择一个合适的耐药突变检测方法进行流行病学调查或检测也必须考虑方法的正确性和可靠性。虽然RFLP和核酸杂交的分析方法等是有用、常见且操作简单的检测方法，但由于病毒变异快速，即使有轻微的碱基变化，就会出现RFLP酶切位点的变化----出现新的酶切位点或原有的酶切位点消失，导致检测失败。近年来发展的自动测序技术能进行重复、敏感和廉价的测序分析，有望成为临床实验室的常规手段。最近有一项研究阐明了利用该技术对肝移植病人移植前、后的HBsAg和pol基因突变进行了检测[35]，这一特别的研究的重点是HBV基因组区的pol/HBsAg片段，目前在作相似的分析进行HBV基因组全序列检测。将来核酸测序分析很可能成为常规病毒药物基因组学的“金标准”，它是一个准确、有效的技术，能为慢性HBV感染病人实施治疗及管理提供关键的分子信息。
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Key words: HBV； lamivudine； drug resistance； Nuclear diagnose
乙型肝炎（Hepatitis B）是由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）引起的一种危害极为严重的传染病。HBV是重要的肝脏疾病致病因子，主要通过性接触和血液传播，也可通过医源性、胎源性、昆虫叮咬或与HBV携带者生活密切接触传播。世界上有20亿人感染HBV，约占全球人口的1/3。目前全世界慢性HBV感染患者至少有3.5亿，其中HBV携带者75%分布在东南亚和次撒哈拉地区，而我国就占了1.2亿。估计全球每年有100～200万人直接死于HBV持续感染[1，2]。慢性乙型肝炎病毒感染者中50%～75%有活跃的病毒复制和肝脏炎症，感染的自然病程漫长，可持续30～50年, 表现为易于慢性化的特征。持续慢性HBV感染在临床上可表现为各种不同类型的疾病，包括无症状携带状态，急、慢性肝炎，重症肝炎，肝纤维化和肝硬化等，有的还可能发展为原发性肝癌（HCC）。
1 HBV基因组的生物学特点
HBV是DNA病毒，基因组全长约3.2 Kb，为独特的带有部分单链区的环状双链模式。基因组简单、高度压缩、重复利用。HBV基因组共含有4个转录单元，每个转录单元构成一个独立的开放读码框（Open Reading Fram，ORF），由于4个转录单元之间相互重叠，其ORF总长为4.7 Kb。HBV的4个ORF（图1,表1）分别为P、X、C、S，其中S ORF长度为1 185 bp，由S、Pre-S1和Pre-S2三个区域组成，各个区都有自己的起始密码ATG，但三个区共同合用5￠ 端的终止密码子。S ORF编码含有226 个氨基酸的包膜主要表面蛋白，又称小表面蛋白或表面抗原，即HBsAg，构成了HBV的抗原特性，是HBV疫苗开发的耙点。C ORF的长度为639 bp，编码HBcAg和HBeAg，HBcAg是免疫攻击的靶抗原，X ORF长465 bp，编码155个氨基酸的X蛋白，是参与细胞凋亡的反式激活蛋白。P ORF长2 532 bp，编码844个氨基酸的P蛋白(即HBV DNA多聚酶)，是病毒复制的主要功能单位，也是抗病毒药物开发的主要靶标。P ORF包括括4个编码区域[3，4]，从氨基端开始分别为：①末端蛋白区(TP)，末端蛋白在逆转录过程中与负链DNA结合。②间隔区(SD)，该区具有耐受突变，缺失并不影响聚合酶的活性。③逆转录酶区（RT），该区包含5个功能保守序列A-E：A区（AA421-436），B区（AA506-528），C区（AA546-550），D区（AA576-589），E区（AA592-600），是维持反转录酶活性所必须，其中A、C、D区为酶与三磷酸核苷结合的结合域，B、E区为RNA模板和引物定位域。目前临床应用的核苷类似药物主要靶点位于逆转录酶RT区的B及C区，HBV多聚酶的催化域是位于C区的YMDD基序。HBV基因型不同，保守区氨基酸位点不一样，该蛋白同时具有依赖RNA的RNA聚合酶活性(RdRP)和依赖RNA的DNA聚合酶活性，即同时有逆转录酶和DNA聚合酶的活性，能将前基因组RNA反转录成负链DNA，并以此负链DNA为模板合成正链DNA。④RNase H区。
2 HBV的耐药性
HBV多聚酶的催化结构在自然条件下很少发生变异,但在长期药物治疗后则极易发生变异，产生耐药性，如临床常见的免疫球蛋白耐药、拉米夫定耐药、更昔洛韦耐药等。耐药后，抑制病毒复制的能力下降，患者血清HBV DNA反弹。各种耐药突变在基因组中核苷酸突变位点不同(表2)。
随着现代医学治疗技术的进步，准确了解某个病人体内病毒的复制状态需要详细的病毒血清学和分子生物学信息，这些信息有助于选择正确的临床管理和治疗方案。HBV耐药核酸检测在临床上能为慢性HBV感染病人治疗方案的选择和调整提供个性化的、关键的分子病毒学信息。
3 HBV拉米夫定耐药突变检测及其临床意义
目前治疗慢性乙肝主要用干扰素或核苷类似物，如拉米夫定、更昔洛韦等，干扰HBV复制来达到治疗的目的[5，6]。拉米夫定（Lamivudine，3TC or Epivir)，中文名贺普汀，是口服胞核嘧啶核苷类似物，由葛兰素史克公司在1992年研发成功并生产，1998年进入中国并被批准用于临床，拉米夫定服用方便、不良反应少，易为患者接受，是目前公认的最有效而安全的抑制病毒复制的核苷类似药物，该药的出现使抗HBV治疗发生了质的飞跃，使不适宜用α-干扰素治疗或治疗无应答病人有了新的治疗选择。
HBV基因组复制要通过逆转录机制才能进行，首先形成RNA复制中间体，而RNA复制中间体的形成需要逆转录酶的作用才得以进行，但该酶缺乏校对功能，逆转录过程中容易发生错配导致基因突变，在HBV基因组中逆转录聚合酶的催化结合部位有一个高度保守的YMDD基序，即酪氨酸-甲硫氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸[7]，拉米夫定能够与其特异性结合，通过抑制前基因组RNA逆转录为负链DNA及终止DNA链延伸而有效地抑制HBV DNA复制[8]，拉米夫定的作用机理是在细胞内转化成活性代谢成分拉米夫定-5￠-三磷酸，它可作为一个链终止子或竞争自然底物dCTP，抑制病毒RNA依赖的DNA聚合酶(逆转录酶)的活性[9]。治疗慢性乙肝的临床试验表明：拉米夫定用药后血清病毒滴度明显减少，有的低至检测不出的水平，丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性迅速降低，血清肝酶活性正常化，肝组织病理改善，HBeAg血清转化成HBeAb，病情稳定，阻止肝纤维化进展[8，10，11]，因此是疗效较好的抗HBV药物。拉米夫定对HBV cccDNA(Covalently Closed Circular HBV DNA,共价闭合环状HBV DNA)无直接作用，短期治疗不能完全清除体内HBV cccDNA[12]，大多数病人需要长期的抗病毒治疗以期耗竭cccDNA库来达到清除HBV的目的。但是长期单一使用拉米夫定治疗后，病毒在药物和人体免疫选择压力下可能产生耐药性，出现一些与以往的药物治疗慢性乙型肝炎类似的问题，例如持续应答率不满意、部分患者停药后复发、需长期用药且出现耐药变异等[13]。拉米夫定耐药突变在用药后6个月开始出现，呈现为逐年用药递增[10，11]，用药1年时有16%-32%患者发生耐药变异，2年时为47%-56%，3年时达69%-75%[14]。YMDD基序是聚合酶活性所必需的，是HBV逆转录酶的高保守区，变异后的HBV对拉米夫定的敏感性下降，从而导致治疗失败，甚至导致病情恶化[15]。如果耐药突变发生后继续用药，不仅增加病人不必要的经济负担和造成社会资源的浪费[16]，还可能存在严重的流行病学危害[17]。de Man等[18]报道1例肝移植手术后HBV感染患者，乙型肝炎免疫球蛋白治疗导致HBsAg逃避变异株，用泛昔洛韦治疗6个月(500 mg， 3次/d)无效，P基因测序发现第513位氨基酸有异亮氨酸→亮氨酸的突变，后改用拉米夫定治疗（100 mg， 1次/d），HBV DNA水平骤降，但拉米夫定治疗12个月后HBV DNA反弹，且发生重症肝炎，最后死亡。测序发现在YMDD区域附近有突变，因此在出现YMDD变异株后很有必要密切监视患者病情变化，包括肝脏功能、HBV DNA定量等。如出现ALT明显升高，临床症状加重，则应立即停药，临床上检测YMDD基序变异对时调整治疗方案、合理用药及提高疗效具有重要的指导意义。
拉米夫定耐药性的产生主要是由病毒基因组变化引起的。近年来报道了拉米夫定治疗乙肝过程中产生的耐药突变主要集中在552位氨基酸的YMDD→YIDD/YVDD，即在HBV YMDD基序区发生碱基替代G743T或A741G，即Atg→Att/Gtg。Locarnini等报道认为M552V 是拉米夫定耐药突变的主要形式，有趣的是有些耐药突变中除了这些碱基突变还常伴有其他碱基突变，如M552V突变总伴随着P基因B区的L528M突变，两种突变同时存在可能与M552V和M552I 耐药性强弱有关[19，20]。动物实验表明各种突变耐药的强弱顺序为：M552 I ＞L528M +M552V＞M552V＞L528M[16]，目前有人建议将这些突变分为Ⅰ组(M552V/L528M)和Ⅱ组(M552I)[16]。其他类型的拉米夫定耐药突变还包括拉米夫定治疗中产生的F512L、V519L和V555I突变，及与Famciclovir耐药相关的L528M、V519L和V555I突变[13，21]。这些突变并不是病毒耐药突变的主要形式，其出现有时可导致病毒复制反弹，HBV DNA及ALT水平升高[22]，所以，在临床上用拉米夫定治疗乙肝的同时要监测病人血清有无耐药性的变化,降低疾病的严重复发。
随着拉米夫定耐药株的出现，国内外研究者都在积极寻找有效的检测方法。目前耐药突变的检测方法主要有以下几种：质谱分析[23]，荧光偏振[24]，PCR-肽核酸[25]，限制性片段长度多态方法RFLP[26]，线性探针分析法LiPA[27]，荧光定量PCR熔解曲线分析法[28]，基因芯片技术[29]。这些方法大多成本昂贵，对技术和设备要求很高或者操作繁琐，耗时费力，不利于广大基层医院开展应用，仍需进一步研究。基因芯片技术目前尚未成熟，芯片制作成本高，临床无法普及。目前临床用得最多的是RFLP，RFLP在HBV耐药检测方面主要检测的是单一类型的感染，对混合型耐药株感染显得束手无策。LiPA和与其原理相似的反向斑点杂交方法（Reverse Dot Blot,RDB）可能是今后临床HBV耐药株检测的主要方法，这类方法最大的优点是一次可以检测多个位点，操作简单，成本低廉。RDB是一种简单的检测基因组突变的有效方法，已经成功地在地中海贫血基因突变检测中应用，可以有效地区分单碱基突变。
中山大学达安基因诊断中心开发出的HBV拉米夫定耐药突变RDB检测试剂盒具有方法灵敏、简便、快捷的特点，能很好地区分HBV野生型YMDD及其变异类型YIDD和YVDD。即能检测单一感染，又能检测混合感染或突变，而且还能根据杂交点颜色的深浅判定病毒裁量达到定量检测突变型病毒的目的，有很好的临床应用价值。该试剂盒主要检测野生型（YMDD）和突变型（YIDD和YVDD），HBV拉米夫定耐药的临床分型检测包括的过程有：血清的获得；血清DNA的提取；YMDD片段的PCR扩增；PCR扩增产物的杂交4个步骤（详见试剂盒说明书）。该试剂盒除设计了各型所对应的特异性探针外，另设计了显色对照探针及野生型和突变型的的阳性标准品，具有完备的质量控制体系；同时配备凯普HHM-2型医用核酸分子快速杂交仪，该杂交仪的设计采用了独特的导流杂交原理，大大增加了核酸分子的扩散率和局部反应的浓度，显著提高了核酸杂交效率，从样本处理到结果判读最快仅需3小时，和传统的杂交相比，其杂交过程具有操作简单、快速（熟练只需40分钟）。由于核酸探针设计的严密性和科学性，拉米夫定耐药HBV检测灵敏度、特异性好，非常适用于临床标本的快速检测和大样本的普查（一次可检测15人份或更多样本）。用该试剂检测结果出现混合感染或者变异株占优势，可决定临床是否再继续使用拉米夫定或停药改用其他药物，新近开发的一些核苷类似药物如阿的福韦，对YMDD变异株仍然有效，将来上市后可以作为治疗这种变异株的有效药物。
要监测耐药性的变化，分析的重点应在P基因的B区和C区。YMDD基序是聚合酶活性所必需的，是所有逆转录酶的高保守区，同时，YMDD基序的聚合酶基因(P基因，即HBV的P区)有足够的变异，能区分HBV的不同基因型，Kato等[30]根据P基因序列对HBV进行了分型分析，分型的结果与已发表的结果进行比较证实了方法的正确性。 Rod?yguez-Nóvoa等[22]针对P基因选择了一段包含YMDD基序，即拉米夫定耐药区段的一短片段序列设计了一种快速、可靠的检测方法，该方法既能检测拉米夫定耐药突变，又能对病毒基因进行基因分型，作者从每一个基因型中选择了一个有代表性的序列(通用序列)进行簇分析，这样基因分型区也是拉米夫定耐药突变区，从同一项检测既可获得病人病毒基因分型的分子信息，也可得到病人病毒拉米夫定耐药性的分子病毒学资料，简少了检测的复杂性，为乙肝病人治疗提供更丰富、可靠的临床分子诊断证据。
HBV基因组的碱基替代突变频率是人类基因组碱基突变频率的104倍[31]。目前有关的病毒变异特点及其临床重要性的数据越来越多[2]，其中最重要的一个是Pre-C基因突变[2]。Pre-C区突变病人的持续病毒血症(Viremia)常伴有进行性肝脏疾病，包括肝硬化和肝癌。HBeAg状态的分子基础目前已很清楚，可能是Pre-C区启动子突变引起或是由HBeAg编码区的突变引起。有趣的是，致HBeAg阴性的突变和病毒的系统分型突变之间有一定的关联。临床上突变的生物学特性很重要，因为虽然用拉米夫定对HBeAg阴性病人治疗的反应与对HBeAg阳性慢性HBV病人治疗相似，但有分子证据表明有些Pre-C突变可能导致对IFN-alpha 耐药性更强[32]，有些突变能进一步导致肝脏疾病，而有些突变可能导致病毒致病性丧失[33]。肝移植或普遍使用预防疫苗人群的HBV临床耐药性用HBV免疫球蛋白(HBIg)也能观测到，这种情况下，突变主要发生在大多数中立的抗原决定基----HBsAg的a抗原决定簇[34]。目前在大面积注射乙肝疫苗的地区广泛使用拉米夫定，这样，HBsAg和P基因双突变可能是一个重要而有意义的临床问题，另外有更多的数据表明HBsAg阴性的病人占了不明病因肝炎的重要比例，但用传统的HBsAg血清学分析方法根本检测不出[2]。所以我们有必要进一步研究更加特异、敏感、快速、简单、廉价的HBV耐药检测方法。
4 总结与展望
HBV感染的临床治疗不能仅限于野生型病毒。详细的病人病毒类型的分子信息显然是很重要的,也是临床个体化治疗实现的基础。临床实践中选择一个合适的耐药突变检测方法进行流行病学调查或检测也必须考虑方法的正确性和可靠性。虽然RFLP和核酸杂交的分析方法等是有用、常见且操作简单的检测方法，但由于病毒变异快速，即使有轻微的碱基变化，就会出现RFLP酶切位点的变化----出现新的酶切位点或原有的酶切位点消失，导致检测失败。近年来发展的自动测序技术能进行重复、敏感和廉价的测序分析，有望成为临床实验室的常规手段。最近有一项研究阐明了利用该技术对肝移植病人移植前、后的HBsAg和pol基因突变进行了检测[35]，这一特别的研究的重点是HBV基因组区的pol/HBsAg片段，目前在作相似的分析进行HBV基因组全序列检测。将来核酸测序分析很可能成为常规病毒药物基因组学的“金标准”，它是一个准确、有效的技术，能为慢性HBV感染病人实施治疗及管理提供关键的分子信息。
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