检测乙肝表面抗原大蛋白应该采用其特异结构型表位抗体
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魏红山 ( 作者简介：魏红山，博士，副主任医师，北京地坛医院病毒研究室主任。 drliver@163.com) |
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概要： 大蛋白（ L 蛋白 , 即 HBsAg 、 Pre-S1 蛋白和 Pre-S2 蛋白）在 HBV 形成包膜的过程中起关键性作用。 研究鸭乙肝病毒发现含有嗜肝病毒的血清的感染性不仅依赖于具有感染性的病毒颗粒（ Dane 颗粒）的多少，而且还依赖于缺乏核酸的亚 病毒颗粒的数量，研究发现亚病毒颗粒在 HBV 感染过程中，能显著增强细胞内的病毒复制和基因表达，而这种增强作用是由大蛋白上的 pre-S 蛋白的反式激活作用所触发的。因此检测 L 蛋白 pre- 区蛋白的存在对于临床上判定肝内 HBV 复制和治疗预后具有一定的意义。以往的检测是通过检测大蛋白的独有片断 Pre-S1 蛋白来实现的，但是编码 pre-S 蛋白的 HBV-LP Pre-S 区具有复杂的拓扑结构，以往使用 Pre-S1 区 AA21-47 多肽作为免疫源制备单抗，导致 Pre-S1 抗原的检出率较低，不能很好的反映 HBV 的复制情况。因此高敏感性检测 L 蛋白的存在应该采用针对其特异拓扑结构区段的单抗。 全文： 乙肝病毒表面抗原（ HBsAg ）是 HBV 的外膜蛋白，由 HBV 基因组的 S 区所编码， S 区分为 preS1 、 preS2 和 S 基因 3 段，它们阅读框相位相同，连续串联排列，可以共用 1 个终止密码。这 3 个基因分别编码三种表面包膜蛋白：（ 1 ）主要表面蛋白：简称主蛋白，由 S 基因编码，是病毒包膜及亚单位颗粒的主要成分，因其分子量小，因此称之为小蛋白，传统上 HBsAg 即指由 S 基因编码的蛋白；（ 2 ）中等分子 S 蛋白（ M 蛋白），由 S 及 Pre-S2 基因区所编码；（ 3 ）大分子 S 蛋白（ L 蛋白），由 S 、 Pre-S1 及 Pre-S2 基因区所编码 【 1 】 。
图 1 HBV S 基因编码的三种蛋白与血清中三种颗粒的关系 HBV 感染者血清中有 3 种不同形态的病毒颗粒：小球形颗粒（直径 22nm ）、管状颗粒（直径 22nm 、长度 100-1000nm ）、 Dane 颗粒。 Dane 颗粒与管形颗粒的包膜蛋白组成相同，每个病毒含有 300 － 400 个分子的 S 蛋白与 40 － 80 个分子的 M 蛋白和 L 蛋白。小球形蛋白的包膜蛋白组成则随病毒是否复制而异：在有病毒复制者中，小球形颗粒包膜上的 M 蛋白和 S 蛋白含量与 Dane 颗粒上的大致相同，存在 L 蛋白，但比例低于 1/20 ，形成管状颗粒；在无病毒复制者中，小球形颗粒的包膜蛋白几乎全部是 S 蛋白，无 L 蛋白，但是仍旧有 1 ％的 M 蛋白 【 2 】【 3 】 。在肝内病毒非复制期，大蛋白在血清中很低和无，大量滞留在肝细胞中。因此可以根据检测血液中大蛋白的有无，来判断病毒携带者体内的 HBV 病毒是否在进行复制。 由于基因组较小，病毒都是利用尽可能小的多肽序列储存尽可能多的信息。因此，很多由病毒编码的蛋白和蛋白结构域都具有多种功能。乙型肝炎病毒的大蛋白（ L ）即是其中的一个例子。该蛋白在病毒进入时作为受体蛋白起作用； 在病毒组装时，则是基质类似蛋白，同时还行使调节功能 【 4 】 。乙肝感染通常导致 10000 倍多于病毒粒子的管状亚病毒颗粒 (subviral particles ， SVPs) 的合成。 SVPs 包含宿主细胞来源的脂质和病毒衣壳蛋白，但不具有病毒核衣壳蛋白和核酸 【 5 】 。乙型肝炎病毒 (hepatitis B viruses,HBV) 的衣壳 L 蛋白，即大蛋白，在病毒生活周期中具有一系列不同的功能 : 感染早期，与细胞受体结合介导病毒粒子的细胞内摄入；感染晚期，他们对于病毒粒子的组装和分泌十分重要 【 6 、 7 、 8 】 。 大蛋白的前 S 区具有独特的立体构象拓扑结构，这个特殊的结构是 L 蛋白发挥多种功能作用的依赖性结构 【 9 】 。最新的研究证明大蛋白上的前 S 区 AA99-169 （横跨部分前 S1 和前 S2 ）形成一个环状，具有表面抗原众多的免疫表位 【 10 】 ，其中 Arg 103 和 Ser 124 之间的序列在不同的 HBV 之间是高度保守的。 Arg 103 和 Ser 124 之间的 pre-S 序列对于 HBV 的形成具有重要功能 【 11 】 ，而这个区段也是横跨前 S1 和前 S2 的。 在组装病毒外壳时，大蛋白在主蛋白和中蛋白的协同作用下，分泌出组装完整病毒外壳，如果缺乏大蛋白，则只能形成不完整的病毒颗粒（球型颗粒）。研究鸭乙肝病毒发现含有嗜肝病毒的血清的感染性不仅依赖于具有感染性的病毒颗粒（ Dane 氏颗粒）的多少，而且还依赖于缺乏核酸的亚病毒颗粒的数量，研究还发现亚病毒颗粒在 HBV 感染过程中，能显著增强细胞内的病毒复制和基因表达 , 而这种增强作用是由大蛋白上的 pre-S 蛋白的反式激活作用所触发的 【 12 】【 13 】 ，乙肝病毒表面抗原大蛋白研究发现乙肝病毒表面抗原大蛋白独特的拓扑结构决定其具有反式激活作用， L 蛋白的前 S1 区和前 2 区有一个与翻译不同步的转位过程，在横跨内质网膜时指向内质网的胞质侧， L 蛋白上的前 S2 区段在翻译后初期定位于内质网的胞质侧，能够激活多种启动子元件，具有同样的转录激活功能．慢性 HBV 感染患者体内 L 蛋白持续过量表达，转录反式激活病毒的启动元件与病毒复密切相关。
图 2 乙型肝炎病毒包膜蛋白的跨膜拓扑学结构 蛋白 S 的跨膜折叠区域在 N 端的 I 型和内部的 II 型信号（空框表示）； C 端区域为疏水区，被认为是包埋进脂双层中（水平空框表示）； C 末端朝向内质网腔； N 联聚糖残基结合于腔环上，用小叉表示。蛋白 M 的折叠方式与 S 蛋白类似， N- 联糖基化的 pre-S2 位于内质网腔。 L 蛋白具两种拓扑结构。开始时 pre-S 结构域均位于胞质内（ i-preS ），约有一半的 L 蛋白会在翻译后重折叠，而将 pre-S 结构域转移进内质网膜的腔内一侧（ e-preS ）。 L 蛋白 pre-S 结构域内潜在的 N- 联糖基化位点用星号表示， S 蛋白的胞质环和 i-preS 结构域的某些区域可能在出芽过程时与衣壳相互作用，用方框表示。（ Volker Bruss. Envelopment of the hepatitis B virus nucleocapsid Virus Research 106(2004)199-209 ）
早在上个世纪 80 年代，关于大蛋白前 S 蛋白与乙肝病毒复制的关系已经引起了人们的广泛注意，检测的意义得到科研领域公认。但是局限于原来的生物技术水平，特别是结构生物学领域的认识和体外 pre-S 区段表达的困难，只能采用多肽合成 AA21-47 作为免疫源使得无法获得针对 pre-S 区特有拓扑结构的抗体，因此检测前 S 抗原检测的手段缺乏，已经商品化的前 S1 试剂与 DNA 之间的符合率不高，相关研究阐述不清，使得大蛋白前 S 区与病毒复制、疾病预后的研究不完整，临床应用不广。 对于前 S 区抗原检测的研究，开始于 1984 年，德国科学家 KLAUS H. 等人使用乙肝感染者的血清分离出乙肝病毒颗粒，分离出一株单抗－ MA18/7 ，但是该单抗后来确定为前 S1 区的线性表位 AA31-3 区段的单抗，没有在临床诊断中应用。 到 90 年代，从蛋白组成上认为前 S1 是 HBV 大蛋白的所独有的片断，因此它作为乙肝病毒复制的新标志一直是乙肝检测领域研究的热点 , 关于前 S 区的研究主要是将前 S1 和前 S2 作为两个独立的单元进行研究 【 14 】 。 90 年中期，国内使用化学合成法合成多肽研制单抗，进行前 S1 的研究： 在我国已经有商品化的前 S1 定性检测试剂（上海阿尔法公司），其单抗是用 AA21-47 化学合成的多肽而制作的 【 15 ， 16 】 。而应用该多肽免疫制作的抗体在科研中就已经发现，只能检测到微弱的抗 -pre-S1 抗体的产生： Schodel 等人曾以 100ug 的 pre-S1(21-47) 合成多肽免疫 Balb/c 小鼠，诱导生成的抗 pre-s1 抗体的滴度只有 160 【 17 】 ，上海生化所改进应用 pre-S1-BSA 偶联复合物免疫 Balb/c 小鼠，也只能检测到微弱的抗 Pre-S1 的活力 【 16 】 ，应用该单抗制作的商品化试剂盒在实际使用中，也发现该前 S1 试剂试剂与两个临床较为公认的病毒复制的指标有一定相关性，但是三个指标差异较大，特别是前 S1 试剂与 DNA 的符合率与理论上有较大的差距。 90 年代末，在军事医学科学院马贤凯等人使用基因重组的前 S 抗原（包括抗原 PreS1 ： 10 － 108 ， PreS2 ： 1 － 55 ）制备多抗组装成试剂盒，在大三阳中的检出率为 87 ％，小三阳检出率为 74 ％。其在大三阳中的检出率较低，而小三阳的检出偏高中，两者之间没有显著的差异。可能是多抗的反应中还有前 S2 片断的反应。而前 S2 的蛋白不仅存在于大蛋白中，还是中蛋白的组成部分，它与 HBV 复制的相关性不够高。由于特异度不高，没有见后来有相关的文章发表 【 18 】 。 此外由于 L 蛋白表达具有很强的细胞内滞留性，因此 L 蛋白前 S 抗原难以体外重组表达，同时该 L 蛋白极容易降解，因此将 L 蛋白前 S 区作为一个整体性对其蛋白功能研究相对较少。国内近期才完整表达前 S 区抗原成功 【 19 】 。 而在国外，针对前 S 区蛋白的整体性构象型蛋白研究日益受到重视 【 20 】 。从 90 年代到现在，德国法兰克福州吉森大学（ University of Giessen, Frankfurter Strasse ）的 Bruss V 实验室对大蛋白的结构、功能做了重要的研究。在很多相关的研究中，前 S 区的特异拓扑结构和功能研究，使得结构型前 S 抗原作为大蛋白特征区域得到深入研究 【 21 】 。其研究证明大蛋白上的前 S 区 AA99-169 （横跨部分前 S1 和前 S2 ）形成一个环状，具有表面抗原众多的免疫表位 【 22 】 ，其中 Arg 103 和 Ser 124 之间的序列在不同的 HBV 之间是高度保守的。 Arg 103 和 Ser 124 之间的 pre-S 序列对于 HBV 的形成具有重要功能 【 23 】 ，而这个区段也是横跨前 S1 和前 S2 的。而由大蛋白组装成的亚病毒颗粒能够反式激活病毒继续复制也有相关乙肝鸭模型证实 【 12 】【 13 】 。这个对于临床具有实际的意义，在临床上，一定比例的小三阳病人［抗病毒治疗后 DNA 阴性（低拷贝数）但是存在亚病毒颗粒（前 S 抗原阳性）］容易停药反跳之间的关联有新的启示。 对于 HBV 外膜蛋白的深入研究，发现大蛋白在完整病毒外壳组装过程中起着决定性作用 【 24 】 。整个前 S 区都暴露在病毒颗粒的表面，在与细胞受体的相互作用中发挥多点联合的作用 【 25 】 ，同时发现前 S(S1+S2) 具有独特拓扑结构，大蛋白在穿越内质网时需要形成双重拓扑结构，大蛋白的折叠使前 S 区形成一个结构型依赖的区域 【 26 】 。而以往使用基因工程表达完整的 PreS 蛋白的稳定性和溶解性较差 , 类似的研究很少有成功体外表达前 S 区蛋白的，而且也很难从血液中分离得到天然的 PreS 蛋白，因此无法对其结构进行深入研究和分析。 表位的构成方式至少有两种： ① 由某些氨基酸残基按一定顺序连续排列组成的线状序列，称为顺序（ sequential ）表位或线性 (linear) 表位。顺序表位是蛋白分子的一级结构，比较稳定，不受蛋白质加热变性和空间构形改变的影响。 ② 由分子内不连续的 2 ～ 3 个氨基酸残基折叠排列所形成的三维结构构成，称为构象 (conformational) 表位；有时候，呈 α 螺旋式排列的连续肽链序列也可起到构象表位的作用。 病毒抗原的免疫检测的研究中，大多数都采用病毒的部分基因重组抗原或合成的多肽制作的单抗。近年来，人们逐渐认识到合成的多肽一般只具有线性表位，而不具有抗体所识别的构象型表位。当病毒的优势抗原表位是具有立体空间构象型的抗原表位时，采用基因重组或合成肽的抗原制作的单抗其检测病毒抗原的灵敏度必定受到影响 【 27 】 ，因此采用最好的办法是采用病毒样颗粒上的天然抗原决定簇或者能模拟其结构的重组蛋白来制作出针对其构象型表位的单克隆抗体。 因此 , 针对 L 蛋白拓扑结构的特异性单抗是检测 L 蛋白的较好选择 . 参考文献 1 金奇 编著 医学分子病毒学 科学出版社 2001 年 2 成军 编著 肝炎分子病毒学 人民军医出版社 1997 年 3 骆抗先 乙型肝炎基础和临床 人民卫生出版社 2001 年 4 Bruss, V., Gerhardt, E., Vieluf, K. & Wunderlich, G. 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Envelopment of the hepatitis B virus nucleocapsid Virus Research 106 (2004) 199–209 11 VOLKER BRUSS A Short Linear Sequence in the Pre-S Domain of the LargeHepatitis B Virus Envelope Protein Required forVirion Formation JOURNAL OF VIROLOGY,Dec. 1997, p. 9350–9357 12 Bruns M,Miska S,Chassot S,Will H. Enhancement of hepatitis B Virus infection by noninfections subviral particles.J rol ,1998;76 ;1462-8. 13 Hildt E, Saher G, Bruss V, Hofschneider PH. The hepatitis Bvirus large surface protein (LHBs) is a transcriptional activator. Virology 1996;225:235-239 14 徐蓓，姚光弼 . 血清乙型肝炎前 S1 抗原检测及病毒复制的关系 . 中华实验与临床病毒学杂志， 1997 ， 11 （ 2 ） :117. 15 杨海林等 完整病毒颗粒 Dane 颗粒标志物 PreS1 蛋白药盒的研制 上海医学检验杂志 1995 vol.10:204-206 16 杨海林等 抗乙肝炎病毒表面抗原 PreS1 （ 20 － 47 ）多肽的制备、性质和应用。生物化学与生物物理学报 1994 vol 26 145-151 17 Schodel F et al,The position of heterologous epitopes inserted in hepatitis B virus core particles determines their imminogenicity.J Virol,1992,66;106 18 Chen Kun et al. 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