FQ-PCR技术评价乙型肝炎不同血清型传染性的研究
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检验医学
2006-12-1 12:43:05
摘要：为探讨HBV－DNA定量聚合酶链反应技术在不同血清型乙型为的传染性中的意义和临床实用性，采用先进的FQ－PCR技术对377例常见不同组合乙型肝炎免疫标志物阳性血清HBV－DNA作定量检测。结果显示：检测出阳性268例，总阳性率为711％。单纯HBsAg(＋)患者的检测阳性率为549％(28／51)。认为运用FQ－PCR技术对乙型肝炎不同血清型HBV－DNA定量分析是评价其传染性的可靠方法。
关键词：HBV－DNA；FQ－PCR；乙型肝炎
中图分类号：R5126＋2文献标识码：A文章编号：1001－5817(2001)04－0604－02
乙型肝炎病毒(HBV)感染时，患者外周血中HBV－DNA是病毒复制活动最直接和可靠的标志[1]。以往临床医生主要依靠乙型肝炎病毒免疫学指标，尤其是HBeAg/HBeAb的消长来判断其传染性。但由于免疫学脂标难以准确、直观地表达患者体内HBV－DNA复制活动情况，从而给临床诊治工作造成了诸多的不便。为了解决以上问题，笔者采用近年发展起来的荧光定量PCR(FQ－PCR)技术对377例常见的不同组合乙型肝炎免疫标志物阳性血清HBV－DNA作定量检测，现将结果报道如下。
1对象与方法11病例标本本组377例均为本院1998年3月～2000年10月期间的住院及部分门诊病人。其中单纯HBsAg阳性组病人51例；HBsAg(＋)、HBeAg(＋)组64例；HBsAg(＋)、HBcAb(＋)76例；HBsAg(＋)、HBeAg(＋)、HBcAb(＋)95例；HBsAg(＋)、HBeAb(＋)、HBcAb(＋)68例，其它免疫标志物阳性组合23例。
23器材乙肝两对半试剂厦门新创公司提供，BIO－450型酶标仪由美国BIO－RAD公司生产；FQ－PCR扩增仪由美国PE公司提供；荧光检测仪(DA620)、DNA提取液、TaqDNA酶、荧光标记引物、HBV－DNA定量标准品(106基因拷贝／μl由中山医科大学提供。
13乙肝两对半实验按说明书操作并对结果采用BIO－450型酶标仪分析FQ－PCR检测：①取50μl待检血清加50μl裂解液混匀100℃水浴10min，12000r/min离心5min。②吸取上清液2μl加入20μl反应管中(含引物、荧光标记探针及TapDNA酶、Mg2＋等反应体系)。同时取梯度稀释后标准品(基因拷贝数：106／μl、105／μl、104／μl、103／μl、102／μl各μl分别加入另5只反应管，阴性对照直接另取一反应管)。③离心数秒，放入PCR扩增仪33℃保温，1min后迅速取出逐一放入荧光检测仪(DA620)，在激发波长487nm，检验波长525nm下读取读数A0。④PCR增扩：93℃预变性2min，再按93℃45s55℃120s，共40个循环。⑤结束后33℃保温，1min后迅速取出逐一放入荧光光检测仪，记录反应后各管读数A1。⑥根据Ax=A1－A0计算出标本反应管与各定量标准反应管的Ax；以标准梯度浓度为横坐标，各以标准反应管的Ax为纵坐标建立标准曲线。⑦从标准曲线上找到标本反应管的Ax所对应的浓度，经换算便可知标本血清中HBV－DNA的浓度。
14统计学处理采用t检验。
2结果
对377例乙肝免疫标志物阳性病例采用FQ－PCR技术共检出阳性268例，总阳性率711％；其中乙肝免疫学标志物单纯HBsAg(＋)患者的检测阳性率549％(28／51)；常见阳性组合HBV－DNA含量检测结果见表1。
3讨论
乙肝患者血清的传染性强弱主要取决于血清中HBV的含量多少。经研究结果表明：在常见的以上几种血清学模式中均存在不同程度的传染性。其中HBsAg(＋)、HBeAg(＋)、HBcAg(＋)组血清HBV－DNA含量高达10802±135拷贝／ml，有时甚至高达1012拷贝／ml，阳性率(916％)均显著高于其他组(P<005)，也具有很强的传染性。以往认为HBsAg(＋)、HBeAb(＋)、HBcAg(＋)组合的传染性低或无感染性。但从上表可见该组病人血清HBV－DNA基因含量10478±086拷贝／ml虽较低，但仍保持一定的水平，说明病人血清出现HBeAb后，虽病情趋向好转，但其传染性仍不可忽视。HBsAg(＋)、HBeAg(＋)组血清HBV－DNA含量10127±187阳性率641％与其它组血清HBV－DNA含量10226±101同性率542％的患者体内病毒复制不大活跃，传染性低(P>005)，但由于肌体内的病毒仍未彻底清除，故仍需采取必要措施给予积极治疗。另外，由于HBV尤其是变异菌株的存在，常常引起血清标志物的复杂变化，导致抗原改变而逃脱肌体的免疫患者血清中HBV含量不失为评价不同血清型乙型肝炎传染性的可靠方法。
参考文献范公忍，汪毅，胡大荣，等有限稀释定量PCR检测血清HBV－DNA的临床应用及意义[J]临床肝胆病杂志，2000；16(4)：228～229赵建平，赵丽莉，陈煜乙肝病毒血清指标与肝组织病毒存在状况的关系[J]临床肝胆病杂志，2000；16(4)：224～225
关键词：HBV－DNA；FQ－PCR；乙型肝炎
中图分类号：R5126＋2文献标识码：A文章编号：1001－5817(2001)04－0604－02
乙型肝炎病毒(HBV)感染时，患者外周血中HBV－DNA是病毒复制活动最直接和可靠的标志[1]。以往临床医生主要依靠乙型肝炎病毒免疫学指标，尤其是HBeAg/HBeAb的消长来判断其传染性。但由于免疫学脂标难以准确、直观地表达患者体内HBV－DNA复制活动情况，从而给临床诊治工作造成了诸多的不便。为了解决以上问题，笔者采用近年发展起来的荧光定量PCR(FQ－PCR)技术对377例常见的不同组合乙型肝炎免疫标志物阳性血清HBV－DNA作定量检测，现将结果报道如下。
1对象与方法11病例标本本组377例均为本院1998年3月～2000年10月期间的住院及部分门诊病人。其中单纯HBsAg阳性组病人51例；HBsAg(＋)、HBeAg(＋)组64例；HBsAg(＋)、HBcAb(＋)76例；HBsAg(＋)、HBeAg(＋)、HBcAb(＋)95例；HBsAg(＋)、HBeAb(＋)、HBcAb(＋)68例，其它免疫标志物阳性组合23例。
23器材乙肝两对半试剂厦门新创公司提供，BIO－450型酶标仪由美国BIO－RAD公司生产；FQ－PCR扩增仪由美国PE公司提供；荧光检测仪(DA620)、DNA提取液、TaqDNA酶、荧光标记引物、HBV－DNA定量标准品(106基因拷贝／μl由中山医科大学提供。
13乙肝两对半实验按说明书操作并对结果采用BIO－450型酶标仪分析FQ－PCR检测：①取50μl待检血清加50μl裂解液混匀100℃水浴10min，12000r/min离心5min。②吸取上清液2μl加入20μl反应管中(含引物、荧光标记探针及TapDNA酶、Mg2＋等反应体系)。同时取梯度稀释后标准品(基因拷贝数：106／μl、105／μl、104／μl、103／μl、102／μl各μl分别加入另5只反应管，阴性对照直接另取一反应管)。③离心数秒，放入PCR扩增仪33℃保温，1min后迅速取出逐一放入荧光检测仪(DA620)，在激发波长487nm，检验波长525nm下读取读数A0。④PCR增扩：93℃预变性2min，再按93℃45s55℃120s，共40个循环。⑤结束后33℃保温，1min后迅速取出逐一放入荧光光检测仪，记录反应后各管读数A1。⑥根据Ax=A1－A0计算出标本反应管与各定量标准反应管的Ax；以标准梯度浓度为横坐标，各以标准反应管的Ax为纵坐标建立标准曲线。⑦从标准曲线上找到标本反应管的Ax所对应的浓度，经换算便可知标本血清中HBV－DNA的浓度。
14统计学处理采用t检验。
2结果
对377例乙肝免疫标志物阳性病例采用FQ－PCR技术共检出阳性268例，总阳性率711％；其中乙肝免疫学标志物单纯HBsAg(＋)患者的检测阳性率549％(28／51)；常见阳性组合HBV－DNA含量检测结果见表1。
3讨论
乙肝患者血清的传染性强弱主要取决于血清中HBV的含量多少。经研究结果表明：在常见的以上几种血清学模式中均存在不同程度的传染性。其中HBsAg(＋)、HBeAg(＋)、HBcAg(＋)组血清HBV－DNA含量高达10802±135拷贝／ml，有时甚至高达1012拷贝／ml，阳性率(916％)均显著高于其他组(P<005)，也具有很强的传染性。以往认为HBsAg(＋)、HBeAb(＋)、HBcAg(＋)组合的传染性低或无感染性。但从上表可见该组病人血清HBV－DNA基因含量10478±086拷贝／ml虽较低，但仍保持一定的水平，说明病人血清出现HBeAb后，虽病情趋向好转，但其传染性仍不可忽视。HBsAg(＋)、HBeAg(＋)组血清HBV－DNA含量10127±187阳性率641％与其它组血清HBV－DNA含量10226±101同性率542％的患者体内病毒复制不大活跃，传染性低(P>005)，但由于肌体内的病毒仍未彻底清除，故仍需采取必要措施给予积极治疗。另外，由于HBV尤其是变异菌株的存在，常常引起血清标志物的复杂变化，导致抗原改变而逃脱肌体的免疫患者血清中HBV含量不失为评价不同血清型乙型肝炎传染性的可靠方法。
参考文献范公忍，汪毅，胡大荣，等有限稀释定量PCR检测血清HBV－DNA的临床应用及意义[J]临床肝胆病杂志，2000；16(4)：228～229赵建平，赵丽莉，陈煜乙肝病毒血清指标与肝组织病毒存在状况的关系[J]临床肝胆病杂志，2000；16(4)：224～225
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