拉米夫定引起HBV基因突变研究进展
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检验医学
2006-12-1 12:43:06
陈昌杰 综述 何蕴韶 审校
[摘要] 拉米夫定（lamivudine）为核苷酸类似物，主要用于抗病毒治疗，长期使用可引起乙肝病毒基因突变，突变主要在聚合酶基因YMDD模序，导致耐药病毒株，影响临床治疗。目前临床检测突变的手段是建立在PCR技术基础上的方法。
乙肝病毒（HBV）感染引起严重肝脏疾病，进一步可发展为肝硬化、肝癌。全球大约5%人口感染HBV。拉米夫定（lamivudine）为核苷酸类似物，通过终止DNA合成，抑制病毒的复制，降低血清HBV DNA和血清转氨酶水平。但长期用药可引起病毒基因突变，产生耐药病毒株。
1 基因组结构
HBV基因结构为具有包膜的部分双链DNA，大约为3200碱基，病毒基因组主要产物包括核心蛋白，多聚酶，大、中、小包膜蛋白和转录调节因子X蛋白。HBV基因组主要有两个特点：病毒基因组紧密包装，读码框架重叠；HBV为DNA病毒，但与RNA病毒一样利用逆转录酶进行DNA复制。逆转录过程具有出现错误的倾向[1]。
基因型与表面抗原亚型 由于HBV基因型不同，所以多聚酶氨基酸数目不同。黄病毒家族包括两个种属，一类感染人和猴、猿和臼齿类，另一类感染鸟类。感染人科动物病毒具有不同的基因型，分类标准如下：基因组序列差异达到或超过8%，或表面蛋白基因差异达到或超过4.1%[2]。HBV至少具有7种不同基因型，分别用大写英文字母A到G表示，其中5种已经分离，可以利用PCR、RFLP、核酸杂交等方法进行基因型系统分析。HBV基因型分布具有地域性的特点，基因型A为野生型，基因型B和C主要分布在亚洲，基因型D分布在南欧、美国、澳大利亚，基因型E主要分布在非洲，基因型F分布在美国和波兰，基因型G分布在欧洲[3]。70年代初，相继发现4个相互排斥的HBV表面抗原决定子，分别命名为d、y、w、r，加上最常见的a决定子,所以表面抗原主要4种表型adw、adr、ayw、ayr,而 w又可以分成w1、w2、w3、w4。表面抗原亚型与HBV基因型之间的关系：基因型C表面抗原亚型为adr、ayr，基因型D表面抗原亚型为ayw2、ayw3，基因型E表面抗原亚型为adw4，基因型F表面抗原亚型为adw3。这种关系不是绝对的，例如基因型A、B、C表面抗原亚型可以为ayw2。
2 HBV多聚酶基因
HBV复制过程中原病毒RNA基因编码HBcAg和多聚酶，多聚酶基因为第二个读码框架，部分与HBcAg3′端重叠。HBV翻译的精确机制还不清楚。HBV聚合酶不需要经过蛋白酶切生成具有活性的蛋白。聚合酶包括4个区域[4]：编码终端蛋白（TP）区域，该蛋白在逆转录过程中与负链DNA结合；间隔区域，该区域具有耐受突变，缺失并不影响聚合酶的活性；逆转录酶区域，该区包含保守序列A到F区，该蛋白具有依赖RNA的RNA聚合酶活性（RdRP）和依赖RNA的DNA聚合酶活性；编码RNA酶H区域。HBV聚合酶没有整合酶活性。
2.1 HBV基因突变
一个持续感染病人，每天大约50%病毒周转率，每天释放1011病毒颗粒到外周血中，HBV逆转录酶区缺少矫正活性，导致每年每个位点达到10-5～10-6突变频率，形成多序列突变体，特别是在抗病毒治疗过程中。另外病毒内dTTP/dCTP环波动引起G到A的超强突变，在一些病毒基因组导致数个Gs替代。 HBV聚合酶包括4个区域，在基因型A，TP氨基端有两个额外的氨基酸TPG17、TPT18，这将影响HBcAg读码框架，但不影响HBeAg抗原，因为长度多态性位于加工位点的羧基端。人类和猿HBV病毒没有这两个氨基酸，在同一位点插入5个氨基酸。长度多态性位点以基因型依赖方式控制多聚酶蛋白的活性。逆转录酶需要蛋白引物的启动。
2.2拉米夫定引起突变的类型
使用拉米夫定治疗1年后，将有可能引起HBV聚合酶基因保守区C的YMDD（酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸）模序中M变成V或I。基因型不同突变位点基因序列数目表示不同，在基因型A为M552V/I，在基因型B和C为M550V/I，基因型D为M539V/I，基因型E和G为M549V/I[5]。有报道认为M552V是拉米夫定耐药突变体的主要形式，L528M仅仅与M552V突变同时存在[6]。有报道在拉米夫定治疗后病人中M552V与M552I突变检出率相同，并在两例病人发现M552I与L528M突变同时存在。在另一篇报道中5例病人中检出M552V与L528M突变，两例检出M552I与L528M突变。L528M与M552V突变同时存在可能与M552V和M552I耐药性强弱有关[7]。体外实验表明各种突变耐药的强弱顺序为L528M
2.3突变引起耐药的原因
根据HIV RT（逆转录酶）和HBVRT之间同源性，在HIV RT晶体结构模型基础上，构建三维HBV RT模型。通过对HBV逆转录酶模型研究，拉米夫定引起突变位点是M552、L528。M552位于YMDD环[12]，而YMDD环为几乎所有逆转录酶核苷酸结合位点。在HBV模型侧链552位与拉米夫定通过范德华力结合，距离大约3A，528氨基酸位于552位附近，与521-537氨基酸形成螺旋，M552位碳和L528位之间的距离是8A，但是在野生型逆转录酶晶体结构之间距离为4A，表明L528与M552与YMDD环和毗邻螺旋接触，M552和L528为野生型氨基残基。但是临床单个突变，L528与I552之间距离低于4A。在临床双突变，L528和M552距离足够近到可以相互作用。但该模型只是模拟天然，未详细描述。推测528位置干扰作用可以通过552位置传到拉米夫定结合位点，拉米夫定与酶结合力与552位置氨基酸侧链长度有关，拉米夫定与酶表面的口袋结合，由552氨基酸形成的，当侧链发生变化时（M-I、M-V），对抗拉米夫定力量增加，最可能的解释是当侧链变小时，结合位点所在的袋变大，对于拉米夫定来讲，就不是最理想的，所以结合力就变弱。其它突变形式作用机制：V521和T532与L528位于同一个螺旋中，该螺旋与YMDD环接近，相互作用与L528位点类似。 L430位于与YMDD环和螺旋接近的β-片层中。L483、L577位置较远，可能与HIV逆转录酶氨基酸突变引起远距离对核苷酸结合位点的作用，但现在还没有完全确定。
3．突变检测方法：
3.1 PCR-RFLP
当进行PCR引物设计时，在突变位点设计引物，并引入限制性酶切位点，PCR扩增后限制性酶切分析片段长度，根据片段长度判断突变类型，该方法广泛采用，灵敏度可以在103检出10拷贝的突变株。以下为利用该方法的报道，Lai利用PCR-RFLP检测335例用拉米夫定治疗1年后的乙肝患者，检出YMDD突变为81例（24%）[13]。Akuta研究213例乙肝患者，HBV类型为A、B、C，拉米夫定治疗1年后，发现HBV/B基因型的YMDD突变率亚洲其他国家的患者高于日本人，基因型C的患者，e抗原阳性患者YMDD突变率高于e抗原阴性患者，表明YMDD突变与基因型无关，与基因型亚型有关，与e抗原状态有关[14]。Ben利用RFLP多态性分析L528M、M552I突变和病毒基因型和前核心突变体的关系，发现所有病人具有聚合酶基因突变[15]。
3.2 PCR-序列分析
根据HBV病毒基因组保守序列设计引物扩增包括YMDD模序的片段，直接进行序列测定，检测突变类型。尽管序列分析是金标准，大部分实验室无设备，成本较高，条件要求高，一般不适用临床检验。
3.3基因芯片技术
选定了HBV P基因的保守区序列，并设计了相关的引物，扩增出包含有YMDD 的变异区的核苷酸片段，针对 L528M，M552V突变位点设计了探针，将探针固定在经过特殊处理的玻片上，并且与特定的PCR法标记扩增的片段来交。经过洗脱后在微排列扫描仪上扫描，用专门的软件分析确定耐药的类型。但基因芯片技术现在尚未成熟，芯片制作成本高，目前临床尚未普及。
3.4PNA-PCR-RFLP
肽核酸介导PCR结合RFLP方法，检测到与105～109野生型同时存在的0.01%～0.001%突变体。在临床暴发以前检测到YMDD突变体比常规方法提前6个月，在18例未治疗的e抗体阳性慢性乙肝病人检测出4例YMDD[16]。该方法可以有效动态监测拉米夫定治疗情况，在开始抗病毒前筛查有无病毒突变体。但该方法技术难度大，还有待进一步研究。
4．目前存在问题
关于HBVRT晶体结构和动力学了解还不深入；核苷酸类似药物除了引起已报道的突变外其它位置的突变；如何建立一个有效的快速简单廉价的方法检测突变，指导临床治疗。抗病毒治疗引起HBV S基因和P基因突变的突变体在病毒学和临床上的意义还有待进一步研究，如何避免由于广泛应用抗病毒治疗引起突变体已成为公众健康的问题。相信随着研究的深入，分子生物学和病毒学的发展，一系列问题将会得到解决。
参考文献
[1] Domingo E,Holland JJ.RNA virus mutations and fitness for survival. Annu Rev microbiol 1997;51:151-178.
[2]Norder H,Courouce AM,Magnius LO.Complete genomes,phylogenetic relatedness,and structural proteins of six strains of the hepatitis B virus,four of which represent two new genotypes Virology 1994;198:489-503.
[3]Van Geyt C,De Gendt S,Romdaut A ,Wyseur A,et al.Aline probe assay for hepatitis B virus genotypes.In:Schinazi RF,,Sommadossi J-P.Thomas H,eds.Therapies for viral Hepatitis.London:International Medical Press,1998;139-145.
[4]Lanford RE,Kim YH,Lee H,et al.Maping of the hepatitis Bvirus reverse transcriptase Tp and RT domains by transcomplementation for nucleotide priming and by protein–protein interaction.J virol 1999;73:1885-1893 .
[5]Lieven J,Stuyver,Steohen A,et al.Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the ploymerase region .Hepatology 2001;33:751-757.
[6]Locarnini S,Birch C,Antiviral chemotherapy for chronic hepatitis Binfection:lessons learned from treating HIV-infected patients.J Hepatol 1999;30:536-550.
[7]Auna Suk-fong lok,Munira Hussain,CarmelaCursano,et al.Evolution of hepatitis B virus polymerase gene mutation in hepatitis B e antigen-nagative patients receiving lamivudine therapy Hepatology 2000;32:1145-1153.
[8]Allen MI,Deslauriers M,Andrews CW ,e t al.Indetification and characterization of mutations in hepatitis B virus resistant to lamivudine.lamivudine clinical investigation Group.Hepatology 1998;27:1670-1677.
[9]Ono-Nita SK,Kato N,Shiratori Y,et al.Susceptibility of lamivudine-resistant hepatitis B virus to other reverstranscriptase inhibitors.J Clin Invest 1999;103:1635-1640.
[10]Lesburg CA,Cable MB,Ferrari E,et al.Crystal structure of the RNA-dependent RNApolymerase from hepatitis Cvirus reveals a fully encircled active site.Nat Struct Biol 1999;6:937-943.
[11]Joseph torresi.The virological and clinical significance of mutations in the overlapping envelope and polymerase gene of hepatitis B virusJ Clin Vir 2002;25:97-106.
[12]Tipples GA,Ma MM,Fischer KP,et al.Mutation in HBV RNA-dependent DNA polymerase confers resistance to lamivudine in vivo.Hepatology 1996;24:714-717.
[13]Lai CL, Dienstag J, Schiff E, Leung NW,et al Prevalence and clinical correlates of YMDD variants during lamivudine therapy for patients with chronic hepatitis B. Clin Infect Dis 2003 Mar 15;36(6):687-696.
[14]Akuta N, Suzuki F, Kobayashi M,The influence of hepatitis B virus genotype on the development of lamivudine resistance during long-term treatment. J Hepatol 2003 Mar;38(3):315-21.
[15]Ben-Ari Z, Daudi N, Klein A, Genotypic and phenotypic resistance: longitudinal and sequential analysis of hepatitis B virus polymerase mutations in patients with lamivudine resistance after liver transplantation. Am J Gastroenterol 2003 Jan;98(1):151-9.
[16]Toshihiko Kirishima,Takeshi Okanoue,Yukiko Daimon et al.Detection of YMDDmutant using a novel sensitive method in chronic liver disease type B patients before and during lamivudine treatment J Hepatology 2002 ;37:259-265.
乙肝病毒（HBV）感染引起严重肝脏疾病，进一步可发展为肝硬化、肝癌。全球大约5%人口感染HBV。拉米夫定（lamivudine）为核苷酸类似物，通过终止DNA合成，抑制病毒的复制，降低血清HBV DNA和血清转氨酶水平。但长期用药可引起病毒基因突变，产生耐药病毒株。
1 基因组结构
HBV基因结构为具有包膜的部分双链DNA，大约为3200碱基，病毒基因组主要产物包括核心蛋白，多聚酶，大、中、小包膜蛋白和转录调节因子X蛋白。HBV基因组主要有两个特点：病毒基因组紧密包装，读码框架重叠；HBV为DNA病毒，但与RNA病毒一样利用逆转录酶进行DNA复制。逆转录过程具有出现错误的倾向[1]。
基因型与表面抗原亚型 由于HBV基因型不同，所以多聚酶氨基酸数目不同。黄病毒家族包括两个种属，一类感染人和猴、猿和臼齿类，另一类感染鸟类。感染人科动物病毒具有不同的基因型，分类标准如下：基因组序列差异达到或超过8%，或表面蛋白基因差异达到或超过4.1%[2]。HBV至少具有7种不同基因型，分别用大写英文字母A到G表示，其中5种已经分离，可以利用PCR、RFLP、核酸杂交等方法进行基因型系统分析。HBV基因型分布具有地域性的特点，基因型A为野生型，基因型B和C主要分布在亚洲，基因型D分布在南欧、美国、澳大利亚，基因型E主要分布在非洲，基因型F分布在美国和波兰，基因型G分布在欧洲[3]。70年代初，相继发现4个相互排斥的HBV表面抗原决定子，分别命名为d、y、w、r，加上最常见的a决定子,所以表面抗原主要4种表型adw、adr、ayw、ayr,而 w又可以分成w1、w2、w3、w4。表面抗原亚型与HBV基因型之间的关系：基因型C表面抗原亚型为adr、ayr，基因型D表面抗原亚型为ayw2、ayw3，基因型E表面抗原亚型为adw4，基因型F表面抗原亚型为adw3。这种关系不是绝对的，例如基因型A、B、C表面抗原亚型可以为ayw2。
2 HBV多聚酶基因
HBV复制过程中原病毒RNA基因编码HBcAg和多聚酶，多聚酶基因为第二个读码框架，部分与HBcAg3′端重叠。HBV翻译的精确机制还不清楚。HBV聚合酶不需要经过蛋白酶切生成具有活性的蛋白。聚合酶包括4个区域[4]：编码终端蛋白（TP）区域，该蛋白在逆转录过程中与负链DNA结合；间隔区域，该区域具有耐受突变，缺失并不影响聚合酶的活性；逆转录酶区域，该区包含保守序列A到F区，该蛋白具有依赖RNA的RNA聚合酶活性（RdRP）和依赖RNA的DNA聚合酶活性；编码RNA酶H区域。HBV聚合酶没有整合酶活性。
2.1 HBV基因突变
一个持续感染病人，每天大约50%病毒周转率，每天释放1011病毒颗粒到外周血中，HBV逆转录酶区缺少矫正活性，导致每年每个位点达到10-5～10-6突变频率，形成多序列突变体，特别是在抗病毒治疗过程中。另外病毒内dTTP/dCTP环波动引起G到A的超强突变，在一些病毒基因组导致数个Gs替代。 HBV聚合酶包括4个区域，在基因型A，TP氨基端有两个额外的氨基酸TPG17、TPT18，这将影响HBcAg读码框架，但不影响HBeAg抗原，因为长度多态性位于加工位点的羧基端。人类和猿HBV病毒没有这两个氨基酸，在同一位点插入5个氨基酸。长度多态性位点以基因型依赖方式控制多聚酶蛋白的活性。逆转录酶需要蛋白引物的启动。
2.2拉米夫定引起突变的类型
使用拉米夫定治疗1年后，将有可能引起HBV聚合酶基因保守区C的YMDD（酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸）模序中M变成V或I。基因型不同突变位点基因序列数目表示不同，在基因型A为M552V/I，在基因型B和C为M550V/I，基因型D为M539V/I，基因型E和G为M549V/I[5]。有报道认为M552V是拉米夫定耐药突变体的主要形式，L528M仅仅与M552V突变同时存在[6]。有报道在拉米夫定治疗后病人中M552V与M552I突变检出率相同，并在两例病人发现M552I与L528M突变同时存在。在另一篇报道中5例病人中检出M552V与L528M突变，两例检出M552I与L528M突变。L528M与M552V突变同时存在可能与M552V和M552I耐药性强弱有关[7]。体外实验表明各种突变耐药的强弱顺序为L528M
2.3突变引起耐药的原因
根据HIV RT（逆转录酶）和HBVRT之间同源性，在HIV RT晶体结构模型基础上，构建三维HBV RT模型。通过对HBV逆转录酶模型研究，拉米夫定引起突变位点是M552、L528。M552位于YMDD环[12]，而YMDD环为几乎所有逆转录酶核苷酸结合位点。在HBV模型侧链552位与拉米夫定通过范德华力结合，距离大约3A，528氨基酸位于552位附近，与521-537氨基酸形成螺旋，M552位碳和L528位之间的距离是8A，但是在野生型逆转录酶晶体结构之间距离为4A，表明L528与M552与YMDD环和毗邻螺旋接触，M552和L528为野生型氨基残基。但是临床单个突变，L528与I552之间距离低于4A。在临床双突变，L528和M552距离足够近到可以相互作用。但该模型只是模拟天然，未详细描述。推测528位置干扰作用可以通过552位置传到拉米夫定结合位点，拉米夫定与酶结合力与552位置氨基酸侧链长度有关，拉米夫定与酶表面的口袋结合，由552氨基酸形成的，当侧链发生变化时（M-I、M-V），对抗拉米夫定力量增加，最可能的解释是当侧链变小时，结合位点所在的袋变大，对于拉米夫定来讲，就不是最理想的，所以结合力就变弱。其它突变形式作用机制：V521和T532与L528位于同一个螺旋中，该螺旋与YMDD环接近，相互作用与L528位点类似。 L430位于与YMDD环和螺旋接近的β-片层中。L483、L577位置较远，可能与HIV逆转录酶氨基酸突变引起远距离对核苷酸结合位点的作用，但现在还没有完全确定。
3．突变检测方法：
3.1 PCR-RFLP
当进行PCR引物设计时，在突变位点设计引物，并引入限制性酶切位点，PCR扩增后限制性酶切分析片段长度，根据片段长度判断突变类型，该方法广泛采用，灵敏度可以在103检出10拷贝的突变株。以下为利用该方法的报道，Lai利用PCR-RFLP检测335例用拉米夫定治疗1年后的乙肝患者，检出YMDD突变为81例（24%）[13]。Akuta研究213例乙肝患者，HBV类型为A、B、C，拉米夫定治疗1年后，发现HBV/B基因型的YMDD突变率亚洲其他国家的患者高于日本人，基因型C的患者，e抗原阳性患者YMDD突变率高于e抗原阴性患者，表明YMDD突变与基因型无关，与基因型亚型有关，与e抗原状态有关[14]。Ben利用RFLP多态性分析L528M、M552I突变和病毒基因型和前核心突变体的关系，发现所有病人具有聚合酶基因突变[15]。
3.2 PCR-序列分析
根据HBV病毒基因组保守序列设计引物扩增包括YMDD模序的片段，直接进行序列测定，检测突变类型。尽管序列分析是金标准，大部分实验室无设备，成本较高，条件要求高，一般不适用临床检验。
3.3基因芯片技术
选定了HBV P基因的保守区序列，并设计了相关的引物，扩增出包含有YMDD 的变异区的核苷酸片段，针对 L528M，M552V突变位点设计了探针，将探针固定在经过特殊处理的玻片上，并且与特定的PCR法标记扩增的片段来交。经过洗脱后在微排列扫描仪上扫描，用专门的软件分析确定耐药的类型。但基因芯片技术现在尚未成熟，芯片制作成本高，目前临床尚未普及。
3.4PNA-PCR-RFLP
肽核酸介导PCR结合RFLP方法，检测到与105～109野生型同时存在的0.01%～0.001%突变体。在临床暴发以前检测到YMDD突变体比常规方法提前6个月，在18例未治疗的e抗体阳性慢性乙肝病人检测出4例YMDD[16]。该方法可以有效动态监测拉米夫定治疗情况，在开始抗病毒前筛查有无病毒突变体。但该方法技术难度大，还有待进一步研究。
4．目前存在问题
关于HBVRT晶体结构和动力学了解还不深入；核苷酸类似药物除了引起已报道的突变外其它位置的突变；如何建立一个有效的快速简单廉价的方法检测突变，指导临床治疗。抗病毒治疗引起HBV S基因和P基因突变的突变体在病毒学和临床上的意义还有待进一步研究，如何避免由于广泛应用抗病毒治疗引起突变体已成为公众健康的问题。相信随着研究的深入，分子生物学和病毒学的发展，一系列问题将会得到解决。
参考文献
[1] Domingo E,Holland JJ.RNA virus mutations and fitness for survival. Annu Rev microbiol 1997;51:151-178.
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[8]Allen MI,Deslauriers M,Andrews CW ,e t al.Indetification and characterization of mutations in hepatitis B virus resistant to lamivudine.lamivudine clinical investigation Group.Hepatology 1998;27:1670-1677.
[9]Ono-Nita SK,Kato N,Shiratori Y,et al.Susceptibility of lamivudine-resistant hepatitis B virus to other reverstranscriptase inhibitors.J Clin Invest 1999;103:1635-1640.
[10]Lesburg CA,Cable MB,Ferrari E,et al.Crystal structure of the RNA-dependent RNApolymerase from hepatitis Cvirus reveals a fully encircled active site.Nat Struct Biol 1999;6:937-943.
[11]Joseph torresi.The virological and clinical significance of mutations in the overlapping envelope and polymerase gene of hepatitis B virusJ Clin Vir 2002;25:97-106.
[12]Tipples GA,Ma MM,Fischer KP,et al.Mutation in HBV RNA-dependent DNA polymerase confers resistance to lamivudine in vivo.Hepatology 1996;24:714-717.
[13]Lai CL, Dienstag J, Schiff E, Leung NW,et al Prevalence and clinical correlates of YMDD variants during lamivudine therapy for patients with chronic hepatitis B. Clin Infect Dis 2003 Mar 15;36(6):687-696.
[14]Akuta N, Suzuki F, Kobayashi M,The influence of hepatitis B virus genotype on the development of lamivudine resistance during long-term treatment. J Hepatol 2003 Mar;38(3):315-21.
[15]Ben-Ari Z, Daudi N, Klein A, Genotypic and phenotypic resistance: longitudinal and sequential analysis of hepatitis B virus polymerase mutations in patients with lamivudine resistance after liver transplantation. Am J Gastroenterol 2003 Jan;98(1):151-9.
[16]Toshihiko Kirishima,Takeshi Okanoue,Yukiko Daimon et al.Detection of YMDDmutant using a novel sensitive method in chronic liver disease type B patients before and during lamivudine treatment J Hepatology 2002 ;37:259-265.
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