医学检验信息网 检验医学 2006-12-1 12:43:06

崔云，张伟，苏勤, 朱少君，冯英明，吴涛，王清图，郭永   第四军医大学学报 2005 年 6 月 第 25 卷 第 12 期

Serodetection of hepatitis B virus transcripts and its significance in verticaltransmission

CUI Yun1,ZHANG Wei1, SU Qin1, ZHU ShaoJun1, FENG YingMing2，Wu Tao3, WANG QingTu4,GUO Yong4

1Department of Pathology,2Department of Oncology,3Department  of General Surgery, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710038, China, 4Women and Children Health Center, Weifang 261000 , China

【Abstract】 AIM: To investigate the significance of viral transcripts in HBV vertical transmission through serodetection.METHODS: Viral nucleic acids were extracted from sera of the HBV surface antigen positive mothers and of their newborn infants. HBV DNA and RNAs, including the fulllength and truncated RNA molecules, were amplified respectively through PCR and RTPCR targeted to the HBV X proteinencoding region. RESULTS: The viral DNA, fRNA and trRNA were detected in HBeAg(+)/ HBeAg(-)mothers at frequencies of 75%, 65%, 70% and 375%, 208%, 583%, respectively. The differences between these two groups were significant for the former two parameters. HBsAg，viral DNA and fRNA were detected in much less infant samples, respectively at frequencies of 91%，45% and 68%. Strikingly, trRNA was detected in 23 samples (523%), whose occurrence appearing correlative to the presence of the RNA element in the sera of the mothers. A signal for trRNA was also observed in 11 of the 15 (733%) infant samples in which immune seroassays only revealed presence of antiHBsAg antibodies. CONCLUSION: Compared with HBsAg, viral DNA and fRNA, trRNA appears early in the blood circulation of most infected infants, thereby being likely to be a sensitive marker for the identification of the vertical transmission of HBV. Its application is helpful for a better understanding of the HBV expression profiles in the infected infants.

【Keywords】 hepatitis B virus;transcription,genetic;serologic tests;disease transmission,vertical

【摘要】 目的： 探讨乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）转录体的检测在母婴传播中的意义．方法： 自HBV表面抗原（HBsAg）阳性母亲及其新生儿血清中提取核酸，经PCR及RTPCR扩增HBV DNA，全长型RNA（Fulllength RNA, fRNA）和顿挫型RNA（Truncated RNA, trRNA），琼脂糖凝胶电泳显示产物. 结果： HBeAg(+)/HBeAg(-)母亲血样病毒DNA，fRNA和trRNA的阳性率分别为75%，65%，70%和375%，208%，583%，两组间前两项指标相差显著.44例新生儿血样HBsAg，病毒DNA和fRNA阳性率分别为91%，45%和68%，显著低于其母亲；儿血中trRNA阳性率达523 %，与其母亲trRNA的存在有一定关联．15例乙肝五项检测仅显示HBsAb阳性的新生儿血样中均未见到病毒DNA和fRNA，但其中11例（733%）可检测到trRNA. 结论： 与HBsAg、病毒DNA及fRNA相比，trRNA可能是HBV母婴传播过程中早期出现的血清学指标，这一指标的应用可能有助于更精确的确定新生儿HBV感染的状态.

【关键词】 肝炎病毒，乙型；转录，遗传；血清学试验；疾病传播，垂直

0引言

我们采用血清转录体检测方法［1,2］，检测HBsAg（+）/HBeAg（+）母亲及其新生儿血清中的HBV DNA和RNA，探讨乙肝病毒转录体［包括全长型病毒转录体（full length RNA, fRNA)］和顿挫型病毒转录体（truncated RNA, trRNA）检测在母婴传播中的意义，以期为监测和确定这种感染状态提供新的血清学指标，并为制定有效的阻断乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV)母婴垂直传播的方法提供新的依据.

1材料和方法

11材料我们共采集了44对（新生儿中,男23，女21）母婴的血清标本（来自山东省潍坊市妇幼保健院）；母亲均为HBsAg（+），其中20例HBeAg（+），无统计学差异（P>005）.高纯度病毒核酸提取试剂盒、核糖体RNA（rRNA）、单管式逆转录（RT）PCR试剂盒、地高辛标记的dUTP以及碱性磷酸酶标记的地高辛抗体均购自Roche公司；ExTaq酶购自宝生物工程有限公司．

12方法

121血清分离和核酸提取孕妇26 wk肘静脉采血2 mL，新生儿分娩后24 h内采股静脉血2 mL．静置30 min后应用低温离心（4000 r/min，20 min，4℃）分离血清．核酸的提取采用高纯度病毒核酸提取试剂盒，按照说明书操作，仅将其中的poly(A) RNA替换为rRNA作为载体RNA，以免与后面使用的oligod(T)引物结合而干扰HBV 3′端的结构分析．200 μL血清标本提取后可得到50 μL的核酸提取物.

122目的核酸扩增针对HBV 基因X区血清核酸的PCR 、RTPCR及探针标记所用上游引物包括txs（1445）： 5′GGA CCG TGT GCA CTT CGC TT 3′，txs1（1454）： 5′GCA CTT CGC TTC ACC TCT GC3′，txs2（1464）： 5′-TCA CCT CTG CAC GTC GCA TG -3′；下游引物包括： txas（1574）： 5′CCT CAA GGT CGG TCG TTG AC 3′ ，xas1（1668）： 5′０AAT TTA TGC CTA CAG CCT CC3′， txas5（1683a）： 5′(T)15 GCT GG 3′.扩增病毒DNA采用50 μL反应体系，Tag DNA聚合酶8335 nkat，引物对为txs/txas，循环条件： 93℃  100 s，90℃  40 s，58℃  50 s，70℃  40 s，35个循环，72℃ 15 min. trRNA的RTPCR系统在逆转录后采用半巢式PCR，引物txas5分别与txs和txs2配对. trRNA扩增用的锚定oligod(T)引物与fRNA的末端18031806位置的结构也有一定的亲和力，故也同时检测fRNA（Fig 1).20 g/L琼脂糖凝胶电泳后观察结果［1,2］.

2结果

21血清中病毒DNA的检测代表性数据见Fig 2.在20例HBeAg(+)的母亲血样中15例检测到XDNA（Fig 2中泳道1，3和5）；24例HBeAg(-)母亲血样中9例检测到XDNA（Fig 2中泳道7），以上两组间差别显著（P<005).新生儿中共2例检测到XDNA，分别来自HBeAg(+)/XDNA(+)和HBeAg(-)/XDNA(-)的母亲，其XDNA的表达较其母亲显著降低.此外，4例新生儿血样呈HBsAg(+)，其中1例伴XDNA(+)（Fig 2中泳道2）.

22fRNA和trRNA的检测如Tab 1和Fig 2所示， HBeAg(+)和HBeAg(-)母亲血样中的fRNA检出率分别为65%（13/20）和208%（5/24），二者差别显著（P<005). 该两组母亲血样trRNA检出率分别为70%（14/20）和583%（14/24），无显著性差别（P>005）.如Tab 2和Fig 2所示，所有18例fRNA阳性的母亲血样也同时呈XDNA和trRNA(+)，XDNA的存在与fRNA关系密切（P<005）；在20例XDNA(-)/fRNA(-)的母亲血样中，10例（50%）可检测到trRNA.

图1fRNA 和trRNA RT-PCR 扩增产物在HBV基因组中的位置 略

表144例HBsAg阳性母亲及其婴儿的血清免疫学标志物，HBV XDNA和转录体检测结果 略

44例新生儿血样中，3例（68%）检测到fRNA，其中2例伴XDNA(+)（Fig 2中泳道2），23例（523%）检测到trRNA，其检出率明显高于fRNA（68%）和XDNA（45%）（P<001).母婴之间trRNA的关系密切，母亲为trRNA(+)的新生儿血样中trRNA检出率（18/28, 643%）明显高于母亲为trRNA(-)的新生儿（5/16, 313%），差别显著（P<005）.15例新生儿乙肝五项检测仅显示HBsAb(+)，XDNA和fRNA均阴性，但其中11例（733%）血样trRNA(+)（Fig 2中泳道6，8）. Line 1-12: Amplification products were detected by staining with ethidium bromide (Eb) and confirmed by SouthernBlotting (Hyb) from the sera of 6 pairs of mothers (1, 3, 5, 7, 9, 11) and their infants (2, 4, 6, 8, 10, 12). The amplification products of XDNA, fRNA, and trRNA were 129, 370, 245 bp, respectively. The serum immunology makers were showed at the bottom; Line 13 and 14: Amplification products of pMT9T40A and pMT9T41A (positive control), respectively; Line 15: Negative control; M: DNA marker.

图26对母婴血清HBV X片段检测结果的代表性数据 略

表2母婴 HBV XDNA和转录体血清检测结果统计对照表 略

  3讨论

早在20世纪80年代就有学者在HBsAg阳性孕妇的流产死胎肝细胞中检测到病毒抗原和DNA［3］，证实了宫内感染的存在. 至今有关这一课题的研究多采用新生儿血进行HBsAg和(或) HBV DNA 的检测， 根据检测方法的敏感性和受检标本的不同， 显示宫内HBV感染率为50%~200% ［4,5］.  随着病毒学和分子生物学研究的深入，HBV 母婴垂直传播的机制正在不断明确［ 6,7 ］. 然而，新生儿HBV感染的早期诊断仍然是影响预防和治疗的难题，这是因为HBsAg 和HBV DNA 在新生儿感染的早期检出率低，而我们建立的血清HBV转录体检测技术为此类研究提供了新的方法［1,2］. 本研究显示母亲为HBsAg(+)的新生儿血中HBsAg和病毒DNA阳性率很低，分别为91%（4/44）和45%（2/44），而trRNA和fRNA的阳性率分别为523% 和68%. 我们的前期的研究提示，病毒RNA检出率明显高于相应DNA的检出率，即部分样本中仅能检测到病毒RNA. 表明在确定HBV感染状态的研究中，病毒RNA 的检测更敏感、对HBV感染状态的反映更全面和具有代表性［ 1，8-10 ］. 本研究表明，在受感染的新生儿血循环中HBV转录体是最早大量出现的病毒产物，有可能做为诊断HBV宫内感染的早期检测指标.

fRNA与HBeAg、病毒DNA呈正相关系，是一个病毒复制的指标，而trRNA标志着一种病毒持续感染的状态，本研究与我们既往研究的结论一致［ 1, 10 ］.与HBsAg（+）母血的表现不同，新生儿血中病毒转录体主要以trRNA形式存在，提示fRNA的转录和病毒DNA复制尚未被激活或者由于某种机制复制过程受到抑制. 在其后的几个月乃至更长的时间内，这些阳性病例中的一部分可能会陆续出现病毒DNA和HBsAg血清学检测阳性，成为显性感染（apparant infection）；另外一部分病例可能一生都不会出现显性感染，却长时间携带trRNA，成为隐匿性HBV感染者(occult infection). 在后一种情况下，患儿体内病毒可能已经被全部或大部分清除，或者仅携带微量有复制缺陷的病毒，成为隐匿性HBV感染者. 隐匿性HBV感染可能是一个重要的公众健康问题，其临床意义尚待更多地观察［ 8, 9 ］.

母亲免疫状态及其血循环中的病毒载量也有可能影响HBV垂直感染的发生［11］. 此研究显示母亲与新生儿血中trRNA的检出关系密切，即母亲为trRNA阳性的新生儿血中trRNA的检出率高于母亲为trRNA阴性的新生儿. 这可能反映了受感染新生儿血循环中不同标志物出现时相的不同，其他病毒成分的出现明显晚于trRNA. 这一点有待进一步研究证实.

血中出现HBsAb婴儿通常被认为具有保护意义，但事实上并不是一种完全的非感染状态.我们以前对HBsAg（-）成年个体的调查显示，部分HBsAb（+）病例为trRNA（+），属于隐匿性HBV感染者［ 110 ］. 本研究显示，15例HBsAb（+）新生儿血样中均未检测到fRNA和XDNA，但其中11例仍可检测到trRNA. 此时trRNA可能是唯一能检测到的标志HBV感染状态的指标.

致谢第四军医大学唐都医院病理科王婧、王姝妹医师及山东省潍坊市妇幼保健院消化科全体同事在本文完成过程中给予大力支持.

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第四军医大学唐都医院: 1病理科，2肿瘤科, 3普通外科，陕西 西安 710038, 4山东省潍坊市妇幼保健院，山东 潍坊 261000

基金项目：国家自然科学基金（30171052）；陕西省科技攻关计划（2003K10G03）

作者简介：崔云（1978-），女（汉族），河南省郑州市人. 硕士生（导师苏勤）.

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