以纳米金为报告系统的病原体快速检测基因芯片的研制

对病原微生物快速、准确的检测和鉴定是临床感染性疾病诊断及治疗的关键，基因芯片技术的出现为建立快速高效的微生物检测方法提供了一个很好的技术平台^[1]。但目前通用的基因芯片技术，多采用荧光素或同位素为信号报告分子，均分别存在着或灵敏度不高、需特殊检测设备，或操作复杂、耗时长、易污染等缺陷，从而限制了该技术在临床检测中的广泛应用^[2-3]。基于这些背景，我室将纳米技术和芯片技术有机结合起来，研制出一种新的基因芯片检测技术——纳米放大检测技术(发明专利公开号：CN1390955A) ^[4]：采用纳米金作为报告分子，充分利用纳米金与银反应可将信号放大10⁶的优势，从而将杂交结果信号进行足够的放大，形成裸眼可见的颜色信号。这样既提高了检测的灵敏度，而且克服了现有技术的不足，使得结果检测、分析的设备和技术大为简化，可望成为新一代生物芯片的检测方法。本研究就是在这个技术的基础上，通过进一步完善及优化纳米金的标记、杂交、银染放大等反应条件和反应步骤，从而建立一套完整的以纳米金为信号报告分子的芯片检测系统的全部技术，使之具有设备简单，灵敏度高，应用范围广，技术稳定易于掌握等特点，达到使基因芯片的检测技术能更适用于临床、普通实验室甚至其它复杂环境的目的。并进一步将之与临床常见病原体的检测结合起来，实现其在临床病原微生物快速、简便、准确检测和鉴定中的应用，从而做到真正充分地利用芯片技术的高通量、特异、敏感、快速的特点，为临床感染的预防和治疗提供重要的指导作用。

1.1.1标准菌株 金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希氏菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853由大坪医院检验科提供；其它菌株：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎双球菌、肠球菌、伤寒沙门氏菌、白色念珠菌以及病毒感染标本：乙肝病毒DNA阳性血清和丙肝病毒RNA阳性血清，均由大坪医院检验科提供，鉴定标准按《全国临床检验操作规程》；质控血清由卫生部临检中心提供。

1.1.2质控基因 苦瓜Chi5基因质粒由西南农业大学生物技术中心惠赠^[5]。

1.1.3主要试剂 纳米金及银染试剂(美国Nanoprobes Inc.)；全部的引物、及探针(大连宝生物生物有限公司)；标本核酸提取试剂盒(深圳匹基生物技术开发有限公司)；醛基化玻璃芯片基(波兰 CEL Associates Inc.)；α-³²P dCTP(北京亚辉生物医学工程公司)。

1.1.4主要实验仪器 Mastercycler Gradient PCR仪(德国Eppendorf)；GDS8000凝胶成像系统(美国UVP Inc.)；GS紫外铰链仪(美国Bio-Rad)；DU640核酸/蛋白定量仪(美国Beckman)；Atlas玻片杂交盒(美国Clontech)；Model 2000杂交炉(美国Robbins Scientific)。

1.1.5临床病人检测标本 由大坪医院检验科收集提供。

1.2.1 PCR扩增反应 引物5’端巯基修饰，反应体系为50μl，体系组成参照试剂说明书(宝生物Code No.:DR001A)，反应条件为95℃ 5min→(95℃ 30sec→55℃ 30sec→72℃ 1min)×35个循环→72℃ 10min。

1.2.2 RT-PCR扩增反应 引物5’端巯基修饰，反应体系为50μl，体系组成参照试剂说明书(宝生物Code No.:DRR024A)，反应条件为50℃ 30min→95℃ 2min (95℃ 30sec→55℃ 30sec→72℃ 1min)×30个循环→72℃ 10min。

1.2.3 探针设计及筛选 根据各靶病原体特异性扩增片段序列，利用arraydesigner 2.0软件设计特异性寡核苷酸探针；并进行探针间、探针与扩增片段间的互补性分析及特异性分析，针对每一待检靶序列优选出一套探针。

利用反向膜杂交技术，用放射性同位素标记待检核酸片段，筛选特异性寡核苷酸探针并验证可靠性和特异性：①寡核苷酸探针3’未端加聚T尾后点于magna尼龙膜上，紫外交链照射使DNA固定在膜上，制成膜芯片；②随机引物标记法标记α-³²P dCTP于待检DNA片段，sephandex G-50分离柱纯化；③预杂交：按每平方厘米膜0.2ml预热至60℃的预杂交液(6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt液，100µg/ml鲑鱼精DNA)，杂交炉中68℃预杂交2小时；④杂交：按50ul/cm²加入杂交液(6×SSC，0.01mol/L EDTA，变性的标记待检核酸，5×Denhardt液，0.5%SDS，100mg/ml变性的鲑鱼精DNA)，杂交炉中45℃杂交6小时；⑤漂洗：2ml 2×SSC／0.5% SDS室温下漂洗5min；2×SSC／0.1% SDS室温下漂洗15 min ；0.1×SSC／0.1%×SDS 40℃下轻轻漂洗30min；最后室温下0.1 ×SSC稍稍漂洗；室温晾干；⑥-70℃冰箱中自显影24小时。

1.2.4 纳米金-核酸标记反应 巯基修饰待检靶序列TCEP还原反应后，立即95℃变性；分别按纳米金：靶核酸摩尔数比为6:1、10:1、15:1、20:1的比例混合，4℃各分别标记0.5、1、2、4、8、12、16、24小时(振荡组放置在微型振荡仪中，于4℃恒温室反应)；标记产物Sephadex G-50分离纯化后，分别测量各管在260nm和420nm处吸光度，计算出标记效率。

1.2.5基因芯片的制备 (1)按图1的排列方式制作芯片，每个探针4个平行点，点样量为0.5µl／点。探针固定终浓度统一为1500 nM。

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(2) 芯片制备：①5’端氨基修饰探针至相应浓度后，用微量加液器点于醛基修饰玻片相应位置；②湿盒中20℃孵育1小时；50℃稍微干燥5min后置37℃过夜干燥；③湿盒中65℃再水合4小时；④50℃干燥后，0.2%SDS清洗1min；去离子水再清洗2遍，各1min；⑤晾干后硼酸盐溶液中(1g NaBH₄ 加入300ml PBS+100ml无水乙醇中) 37℃孵育5min；⑥0.2%SDS清洗1min，去离子水清洗2遍，各1min，空气中干燥后室温保存待用。