严重急性呼吸综合征患者血清特异性抗体变化规律研究
严重急性呼吸综合征（SARS ）作为一种新出现的跨地区、跨国界传播的病毒性疾病，给人民的身体健康造成严重危害。在发病早期，大部分病例表现为家庭和医院聚集性感染[1]。为进一步了解SARS感染的流行病学特点及探讨其血清特异性抗体的变化规律，本研究对14例SARS家庭聚集性患者血清中特异性抗体进行连续1年的追踪观察，现将结果报告如下。
1.1 对象 2003年2月15日至3月29日收集（出现2例及以上病例家庭）共14例病例(不含死亡4例)，涉及5户家庭，其中发生2例病例的有3户，发生5例病例的1户，发生7例病例的1户。潜伏期3-10d。男性患者8例、女性患者6例，年龄22-73岁，平均年龄45岁。以上临床确诊病例，其之间有明确的流行病学联糸，即都有明确SARS接触史，其中3例患者因其它疾病在医院住院，另11例患者是到医院探望和照顾病人。另外在5户家庭中有10例未发病的成员，均有家庭密切接触史,但无任何临床症状，其中男性4例、女性6例，年龄9-58岁，平均年龄32.6岁。
1.2．临床表现 在14例患者中首发症状以发热占多数，病程中发热100%，10例伴随以下1种或多种症状，如咽痛、全身不适、恶心、呕吐、干咳、畏寒、乏力、气促、肌肉痛疼，其中7例患者伴有腹泻症状。体温38.2-39.7℃, 血常规: 12例患者白细胞4.08-6.59×109/L, 2例患者白细胞2.60-3.40×109/L；10例患者淋巴细胞绝对值0.40-1.0×109/L, 4例患者1.20-2.30×109/L。胸部χ线: 全部病例肺部呈不同程度的片状、斑片状浸润性阴影或间质性改变, 部分病人进展迅速,波及单侧肺野或双侧肺野,常规抗感染治疗无效.
1.3.病例A: 男73岁,于2003年2月15日出院，到某酒家聚餐, 2月17日开始发热，咳嗽，2月19日症状加重，由病例A爱人陪同入广东省中医学院二沙岛分院。2月20日患者出现腹泻。21日行气管插管，2月22日死亡。当时诊断为“肺炎”。由于在发病及住院期间，病例A爱人及子女多次到医院探望。病例A爱人于2月22日感到疲劳不适，26日高烧入中山医学院附属医院，3月1日开始腹泻，病情加重上呼吸机治疗，3月19日死亡，诊断为“非典”。3名子女在2月27日开始轮流照顾其母，先后于3月1-5日出现发热伴腹泻，拍片显示“肺部感染”，分别于3月4-6日住院，诊断为“非典”，14-15d 3人都治愈出院。但一直与家人同住的2名9岁、12岁儿童均未发病（半年内检测SARS特异性抗体为阴性）。此家庭共5人被感染，其中2人死亡。B: 男50岁，职员, 2003年2月25日发病。发病前曾到医院照顾患胃病的妻子。3月2日因发热入177医院治疗,诊断为“非典”。14d治愈出院。3月3日其妻子病情恶化，3月14日上呼吸机抢救无效死亡。在此期间病例B的岳父，岳母，女儿，兄弟，内弟到医院探望和照顾病例B的妻子，3月13-19日5人先后被感染住院，均被诊断为“非典”， B的岳母医治无效死亡。其他人14-19d治愈出院。此家庭共7人被感染，其中2人死亡。
2.1.标本采集 14例SARS家庭聚集性感染者血清来自广州地区5户家庭的长期追踪，血样采集时间分别在发病的第7，14，30，60，120，180 ，210 ，270d,360d.同时收集10例未发病成员血清，分别与患者摘触后第14，30，60 d采集。对照组30例，其中健康体检者20例，非SARS住院患者10例（肺气肿3例、肺癌2例、肺结核2例、支气管哮喘1例、支气管炎2例），其中男性占17例，女性13例，年龄19-71岁，平均（42±15岁）。
2.2.SARS特异性IgG、IgM抗体检测 采用间接免疫荧光染色法（IFA），试剂盒由军事医学科学院微生物流行病研究所提供[3]。批号20030006。将患者血清56℃30min灭活，分别做1：10，1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640，1：1280，1：2560倍比稀释，稀释后取20μl 分别滴在抗原片不同的孔内，每张抗原片同时设阳性和阴性对照。同时检测10份未发病成员血清、20份健康体检者血清、10份非SARS患者血清作为对照组。将抗原片置于37℃120min结合，然后加入抗人免疫球蛋白IgM或 IgG荧光抗体，进行染色并在荧光显微镜下观察荧光图像及强度，根据染色形态和荧光的强度进行结果判定，抗体强度+ - # 计为阳性，抗体强度－-±计为阴性。以最高抗体滴度的阳性结果值为计算值。统计学分析采用SPSS11.0软件,抗体滴度的曲线图采用几何均数表示。
1.3.N蛋白抗体滴度检测 采用双抗原夹心ELISA方法，试剂盒由华美生物工程公司和军事医学科学院生物工程研究所共同研制[4]。将患者血清分别1：10，1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640，1：1280，1：2560倍比稀释，稀释后取50ul加入包被有SARS病毒N蛋白的酶联孔中，37℃孵育30min，洗板5次后，加入酶标抗原100μl，37℃孵育30min，洗板同上。用TMB显色加入终止液后450nm 波长测定吸光度（A）值，阴性、阳性和被检样品的A值即为计算值，临界值（cut off 值）的设定：cut off 值=0.10+0.5×阴性对照均值。被检样品的A值大于临界值判为SARS冠状病毒N抗体阳性反应,小于临界值判为阴性反应。每份标本重复测定2次，2次结果均一致。同时检测10份患者亲属血清，并取健康体检者血清20份，非SARS患者血清10份作为对照组。统计学分析采用SPSS11.0软件,抗体滴度曲线图采用几何均数表示。
2.1.SARS特异性抗体IFA检测结果 14例SARS患者发病第7d， IgG抗体滴度检出1例，滴度为1/40(临界值为1/20)，14 d检出13例，平均滴度1/107，30d14例患者全部检出平均滴度1/400，60d抗体平均滴度1/628，120d达到高峰，平均滴度1/1120，180d开始下降，平均滴度1/262，360d平均滴度1/71.特异性抗体IgM滴度第7d均为阴性，14d检出10例，平均滴度1/32，30d检出13例，抗体达到高峰，平均滴度1/101，60d滴度开始下降为1/86，180d后患者IgM抗体基本消失。同时分别检测10例未发病家属14，30，60，120，360d的血清，10例非SARS住院患者，20例健康体检者血清，其特异性IgG、IgM抗体全部为阴性。IFA法连续检测14例SARS患者血清特异性IgM、IgG抗体结果见表1.
2.2.SARS病毒N蛋白抗体检测结果 14例SARS患者发病于第7d，N蛋白抗体检出2例，平均滴度1/57（临界值为1/20），14 d检出13例，平均滴度1/67，30d14例患者全部检出，平均滴度1/91，60d抗体滴度1/135，120d达到高峰，平均滴度1/319。180d后有9例患者N蛋白抗体平均滴度为1/179，210d平均滴度为1/146；360d平均滴度为1/146；与IgG 抗体变化同时呈下降趋势。但同时另外5例患者，（临床症状较重）180dN蛋白抗体滴度却显著上升，平均滴度为1/790，210d后平均滴度下降为1/259。同时分别检测10例未发病家属14，30，60，120， 360d的血清、10例非SARS住院患者、20例健康体检者特异性抗N蛋白抗体，全部为阴性（OD值0.03-0.07）。SARS病毒N蛋白抗体变化规律（见表2、图1）.
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3. 讨论2003年2月至2004年6月期间，对SARS感染病例进行追踪调查，聚集性病例是SARS流行的一个共同特点[5-6]。本研究中18例病例（4例死亡）属于家庭聚集性病例，涉及5户家庭和3所医院。流行病学接触史是SARS诊断的重要依据，18例患者中14例有明确病人接触史，4例接触史不详，是否与存在环境或动物贮菌源或末明的传播途径有关，尚需进一步研究证实。14例患者发病前1-2周有医院暴露史和家庭接触史，提示医院暴露史及家庭接触史可能是聚集性病例发生的高危因素。
呼吸道传染病，经过全球大流行之后，按一般规律人群有一定的免疫水平，但SARS似乎不符合这种规律。本研究采用IFA和双抗原夹心法追踪检测10例家庭密切接触者血清抗SARS抗体，追踪时间一年。其血清抗SARS IgM类抗体及IgG类抗体始终为阴性。结果提示SARS可能不存在隐性感染，与有关文献报道一致[7-8]。
由图1可见，IFA和双抗原夹心法检测14例SARS患者血清中三种特异性抗体，IgM类抗体120d左右全部消失，IgG类抗体及N蛋白抗体360d仍维持在一定高度，呈缓慢下降趋势。在疾病发展过程中，IgG类抗体滴度始终高于IgM类抗体滴度。从特异性抗体产生的时间看IgM类抗体几乎与IgG类抗体同时出现，而N蛋白抗体出现时间最早。出现与抗体产生规律不符现象，可能与在SARS的感染过程中机体免疫功能状态及免疫细胞对抗原的免疫反应强度有关。由于机体免疫机制损伤可能是造成IgM特异性抗体产生迟缓的生要原因。部分SARS重症患者恢复后期血清N蛋白抗体突然升高，提示N蛋白抗体变化规律与病情轻重程度有关，即重症患者N蛋白抗体高峰延迟出现。本研究结果显示，IgG类抗体及N蛋白抗体在患者体内可长期续存1年以上，这将为临床SARS患者的确定诊断和各类SARS疫苗的研制提供重要的理论依据。
