生物芯片的制作过程实质上是生物分子在载体表面的固定过程，其固定化方法包括物理吸附和化学偶联两大类，无论采用哪一类方法，都必须对固相载体表面进行修饰。在用作微阵列的基底表面中，目前较为理想的载体表面是渗透滤膜（如硝酸纤维素膜、尼龙膜、或PVDF膜）以及包被了不同试剂（如多聚赖氨酸或聚丙烯酰胺）的载玻片等[1]。我们最近以琼脂糖凝胶膜为基质片用于蛋白质分子的固定，发现这种三维的凝胶表面较二维的“刚性”结构更适于捕获生物分子（与用其它化学方法修饰的载玻片相比较），而且生物分子能很好地保留生物学活性[2]。
琼脂糖分子主要由1，3联接的β–D吡喃半乳糖和1，4联接的3，6脱水α-D吡喃半乳糖交替而成，在形成凝胶过程中不会发生自由基的聚合，所以无需催化剂。当琼脂糖凝胶组装膜遇到含有待组装的生物分子的缓冲溶液时，即会发生溶涨而成为具有多孔的网状结构，因此具有类似于聚丙烯酰胺的水凝胶特征。这种结构既有利于生物分子渗入到凝胶的微孔内，还提高了生物分子的组装数量，对实施微量分析技术，以及提高检测方法的灵敏度极为有利[3-6]。由于蛋白质结构种类众多、功能复杂多样，尚无类似DNA的扩增方法，亦难于在固相支持物表面合成，且初生态的蛋白质需要进行多步骤的剪切修饰，才能有生物学活性，因此要沿用DNA芯片（DNA chip）模式来发展蛋白质芯片还不可能实现[7-9]。另一方面，组成蛋白质分子的氨基酸一级结构，还必须有适当的四级结构才能有生物学功能。但固定后的蛋白质分子极易改变其原有的空间构象而失去生物活性，从而成为影响和制约蛋白质芯片发展的主要障碍[10]。
传统物理吸附的方法用于生物分子固定可导致分子构象多方面的改变[12]，它需要克服与固相载体之间的排斥力，重新分布其表面的功能团（如疏水基团的充分暴露等），且被固定分子吸附的效率低并呈现随机和不规则分布，仅有约5%的分子保留有抗原-抗体结合活性， 因此在阵列芯片制作时是不可取的。目前常用的方法主要是通过共价键键合模式将生物分子固定至载体表面。除蛋白质分子外，其他的生物大分子，如磷脂和DNA等亦有可能被用作探针，并与蛋白质分子一起被固定至芯片表面（以用于与其相对应抗体分子的检测）。但这种将不同性质的生物分子（磷脂、重组多肽、DNA和蛋白质等）同时组装于同一载体表面尚未见有相关的文献报道。本文主要利用琼脂糖凝胶粘结层结合分子组装技术，在玻璃固相载体表面形成一层自组装膜，并用于蛋白质与其他不同性质生物分子的固定，同时采用酶免疫分析技术（EIA）、原子力显微术（AFM）与X射线光电子能谱（XPS）对固相表面反应特性、端基的氧化修饰及蛋白质分子的固相化过程进行表征，以期探讨琼脂糖凝胶表面在阵列芯片中的应用价值。
1 材料与方法
1.1
主要试剂与抗原分子制品 3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(APTES)、琼脂糖（Agarose）、3,3-二氨基联苯胺盐酸盐(DAB)、 组蛋白（histone）和牛血清白蛋白（BSA）均为Sigma
公司产品。辣根过氧化物酶（HRP）、山羊抗人IgG, 购自上海生物制品研究所，其酶结合物（HRP-GAHIgG）采用改良过碘酸钠法自行标记
[11] 。人IgG的纯化参照文献
[12]用50%饱和度硫酸铵盐析和DEAE-纤维素离子交换色谱法提取。人子宫内膜抗原（EmAg）、人卵巢抗原（O-Ag）、精子膜抗原（SmAg）、人甲状腺球蛋白（TG）、人甲状腺过氧化物酶（TPO）、重组人亲环素A（rhCyPA）、重组人钙调素（rhCaM）、心磷脂（Cardiolipin）、小牛胸腺可提取核抗原（ENA）、热聚合兔IgG（AgRIgG）、人肌红蛋白（Mb）、肝特异性细胞膜脂蛋白（LSP）、质粒双链DNA（dsDNA）和单链DNA（ssDNA）均由本室自行研制；自身抗体阳性混合血清取自南京军区南京总医院住院患者，戊二醛(GA)和其他化学试剂均为国产分析纯。
1.2
实验方法
1.2.1
固相琼脂糖凝胶表面的制作与表面修饰 将洁净的羟基化表面处理的载玻片置于2 ％（V/V）浓度的3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(APTES)丙酮溶液中，浸泡经过5 min后取出, 依次用丙酮和乙醚漂洗3次，置电热恒温箱（120 ℃）烘烤2h，自然冷却后置于水平表面，浇注 1%（m/V） 的琼脂糖-甲醛（用pH 8.6的0.05 mol/L 巴比妥缓冲液配制, 基片用于XPS表征测试时不含甲醛），每张玻片2ml，使其均匀平铺于基片表面，凝固后置37℃ 烘干，得到表面1；将其置于0.1mol/L NaIO
4溶液中，室温氧化20min, 再用蒸馏水洗片3次，每次15min, 晾干后得到表面2；在此基础上，再将表面2浸入到含1% GA的0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）溶液中，37℃作用4h后，用蒸馏水洗片3次，每次15min, 晾干后得到表面3。分别将上述获得的3种琼脂糖凝胶表面置阴凉干燥处备用。
1.2.2
琼脂糖凝胶表面用于蛋白质分子的固定 所有被固定的HRP与纯化人IgG分子均为4点设置，每点点样量为50nl，均用含40%甘油的0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液（CBS）溶解稀释，分别以一系列规定的浓度点于上述修饰的基片表面，于37℃孵育4h后，用含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液（0.01mol/L pH7.4 PBS-Tween, PBS-T）荡洗3次，每次15 min，浸入含0 .1g/L的BSA-PBS溶液中，以封闭阵列基片表面尚存的空白结合位点，37℃继续反应 2h，洗涤后用吸水滤纸将微阵列四周的液体吸干后再行检测。
1.2.3
抗原分子微阵列的设计与制作 每种抗原分子均为相邻4点阵设置，阵列的4角为自身抗体阳性对照点，与此相比邻的是阴性对照点，同时设试剂（不含任何蛋白或抗原分子的稀释缓冲液）空白对照，中间为已知的自身抗原分子微阵列。制作时将不同的抗原分子（点样浓度预先摸索，分别为50 mg/L～300 mg/L不等）点至上述醛化的琼脂糖凝胶组装膜表面（表面3），阳性对照点以人IgG或兔抗人IgG点制，阴性对照点则以BSA代替，同上述蛋白质分子固定程序制作抗原分子微阵列。
1.2.4
生物分子的相互作用与信号检测 将一定稀释度的血清样本200μl与阵列芯片孵育，37℃ 作用40min后，用PBS-T洗涤3次，每次15 min；再用酶标记的抗体(HRP-GAHIgG)与微阵列于37℃继续反应40min（用直接法测定时，无需与血清样本孵育），同上洗涤后分别与新鲜配制的酶底物(DAB-H
2O
2)，于37℃避光作用10min，用蒸馏水洗片后晾干，CCD摄像扫描记录结果 (Mustek F/B scanner, 台湾Mustek公司)，最后用 Adobe photoshop 6.0图像处理软件分析微阵列中各斑点的显色强度(%)。
1.2.5
原子力显微镜(AFM)表征 用原子力显微镜（Nanoscope Ⅲa型，Digital Instrument，Santababara美国），分别对3种琼脂糖凝胶膜表面固定蛋白质分子（IgG）前后进行对比观察。为便于结果表征，需要制作更为平整的基底，琼脂糖凝胶膜的制作除采用常规的沉积法外，还采用旋涂 (Spin coating) 的方法制备，后续修饰步骤与蛋白质分子的固定过程均按上述方法操作，再用双蒸水洗涤5次，5min/次，晾干后备用。AFM采用非接触模式(Taping mode)，所有检测均在室温大气环境下进行
[13]。
1.2.6
X射线光电子能谱(XPS)分析 电子能谱仪（550型，美国PHI仪器公司）分析时，以X光源Al作为阳极靶，加速电压为10kV，电流为30 mA，能宽(Pass energy)为50 eV, 单色化后能宽度小于0.2eV。光电子能谱以-C-C-链中C1
S能谱峰（285.0 eV）校正
[14]。
2 结果与讨论
2.1
固定转化率和灵敏度 分别选取上述3种琼脂糖凝胶表面用于HRP分子固定效果的测定，结果用固定转化率进行评价。将一定浓度的HRP溶液直接点样于2张平行分析的基片表面，按照选定的条件进行生物分子的固定，其中1片经与酶特异性底物作用后即扫描记录结果，测定并取其平均灰度值（
A1），另1片则模拟真实的反应条件及洗涤条件处理后，测定其显色强度并取其均值（
A2）。按照公式：固定转化率=A2/A1×100%，重复测定6次，计算在所选固定条件下该种表面对HRP分子的平均固定效率。HRP分子在3种琼脂糖凝胶表面上的固定效率见表1。统计分析结果表明，琼脂糖凝胶经氧化（表面2）及后续的GA修饰处理（表面3）对HRP分子的固定效率有了显著的提高（
p ＜0.001＝，其中尤以后者更为明显。
表1. HRP分子在3种不同琼脂糖凝胶表面的固定效率
Table 1. The efficiencies of HRP immobilized on 3 different agarose-gel surfaces
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