目前发现，逆转录酶是所有逆转录病毒中的一个重要标志，凡是逆转录病毒中均携带逆转录酶，逆转录酶活性的高低可即时反映逆转录病毒的感染程度，而不受病毒基因序列的影响。在过去几年中，国内外文献多次报道了逆转录病毒及逆转录酶的检测方法，我们以MS2 RNA为模板，采用荧光产物增强逆转录酶活性分析（single-tube fluorescent product-enhanced reverse transcriptase assay , STF-PERT），用于临床标本和献血员中逆转录病毒的检测。此方法对及时发现逆转录病毒感染，提高生物制品、血液制品、活性疫苗等制品的安全性有着十分重要的意义。
1 材料和方法
1.1
材料 由西安市中心血站随机抽检的500份献血员血液样本；引物及探针的设计：Primer A: 5’-GCC TTA GCA GTG CCC TGT CT-3’ ，Primer B: 5’-AAC ATG CTC GAG GGC CTT A-3’，Probe: 5’-FAM-CCC GTG GGA TGC TCC TAC ATG TCA-TAMRA-3’，由美国华盛顿病毒研究所唐方信博士提供，上海生化生工工程公司合成； MS2 RNA模板，购自罗氏诊断试剂公司。M-MLV逆转录酶，购自华美生物公司。以上试剂和标本均用DEPC处理水制备。
1.2
方法
1.2.1
标本处理及病毒裂解 在500ul血清中加入250ul含30% PEG 的0.4mol/L NaCl，4℃ 2 h。离心2800 r/min，30m in。弃上清，加入50ul 病毒裂解液（含0.8 mol/L NaCl，0.5% Triton X-100， 0.5mmol/L苯甲基磺酰氟，20%甘油，50mmol/L pH7.9 的Tris，1mmol/L DTT），37℃ 30min，12000r/min，离心15min，取上清备用。
1.2.2
逆转录反应 反应总体积为25ul, 包括10×PERT RT Buffer 2.5 ul，2.5 mM dNTPs 2 ul，25 pmol/ul primer A 1.3 ul，40 U/ul RNasin 0.2 ul，100 mM DTT 0.5 ul，MS2 RNA 300ng/ul 1ul，样品处理上清 10 ul，H
2O 7.5 ul。反应条件为37°C 90 min，95°C 10 min。
1.2.3
PCR反应及荧光信号检测 将以下PCR反应液（10×PCR Buffer 5 ul，2.5 mM dNTPs 4 ul，25 pmol primer A 1ul，25 pmol primer B 1ul，7.5 pmol probe 0.3ul，500 ng/ul RNase 1ul，5U/ul AmpliTaq 0.5 ul，H
2O 11.5ul）直接加入逆转录反应管中， 置PE7700型荧光定量PCR仪上扩增，循环参数为95°C 15 sec，56°C 30sec，30个循环。
1.2.4
方法的敏感性测定 取AMV逆转录酶2 ul经10倍连续梯度稀释，浓度依次为：25、25×10
-1、25×10
-2、25×10
-3、25×10
-4、25×10
-5、25×10
-6、25×10
-7、25×10
-8、25×10
-9U/ul，分别取0.5ul加入PCR反应体系中，实验条件与上述反应相同。
2 结果
2.1
方法的敏感性测定结果 取AMV逆转录酶经连续梯度稀释后，经PCR循环反应，得到与理论值完全相符合的PCR荧光值曲线。当AMV逆转录酶稀释到10
-8时，仍可得到相应的荧光值。详细结果见表1。阴性对照为无RT和无MS2 RNA。
2.2
500份献血员样本测定 将500份献血员血样标本，经标本处理后用我们建立的方法检测RT活性，结果有19份血样中RT活性阳性，阳性率为：3.8%。
2.3
用目前所用筛选方法与RT活性测定结果 目前我国在对献血员筛查中，普遍只对HIV、HCV和HBV进行筛查，一般不进行其他病毒类做筛查。用常规筛选方法检测500份献血员血样，有1份HIV可疑结果，有2份HCV阳性，有5份HBV阳性，共8份，筛检率为1.6%。
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表1
AMV逆转录酶梯度稀释后所得荧光值
| AMV浓度（U/ ul） | 荧光值 |
| 25 | 5.2×107 |
| 25×10-1 | 1.8×107 |
| 25×10-2 | 8.6×106 |
| 25×10-3 | 2.4×106 |
| 25×10-4 | 4.4×105 |
| 25×10-5 | 8.8×104 |
| 25×10-6 | 1.4×103 |
| 25×10-7 | 5.2×103 |
| 25×10-8 | 6.8×102 |
| 25×10-9 | ＜80（检测不到荧光值） |
| 阴性对照 | ＜80（检测不到荧光值） |
3 讨论
逆转录酶是一种依赖RNA的DNA聚合酶，是逆转录病毒特有的一类酶。研究发现，越来越多的逆转录病毒（艾滋病病毒、丙肝病毒、EB病毒、单疱病毒、巨细胞病毒、流感病毒等）能够传染人类及多种物种，引起免疫缺陷、白血病和淋巴细胞癌等。在其复制过程中，形成新的逆转录病毒DNA，整合到宿主细胞染色体中，激活或灭活细胞基因，引起突变和重组。逆转录酶是一种依赖RNA的DNA聚合酶，是逆转录病毒特有的一种酶类，逆转录酶的基因存在于某些哺乳动物和禽类。逆转录酶是所有逆转录病毒中的一个重要标志，凡是逆转录病毒中均携带逆转录酶，逆转录酶活性的高低可即时反映逆转录病毒的感染程度，而不受病毒基因序列的影响。
我们根据逆转录酶病毒所共有的逆转录酶基因设计引物及探针，经荧光标记所建立的荧光产物增强逆转录酶活性分析（STF-PERT）定量方法，对献血员血样中逆转录酶活性测定，具有较高的使用价值。研究结果发现，逆转录酶经PCR循环反应后可得到与理论值完全相符合的PCR荧光值曲线；当AMV逆转录酶稀释到10-8时，仍可得到相应的荧光值，证明具有较高的敏感性；在对献血员血样检测中发现，逆转录酶活性筛选率达3.8%，而在现用筛选方法中包括HIV、HCV和HBV总筛选率只有1.6%。因此，认为现用临床输血献血员筛选方法，并不能完全包含所有逆转录酶病毒类，可能检测不到所有检测献血员中血样中的逆转录酶活性，对及时发现逆转录病毒感染，提高临床输血安全性有着十分重要的意义。
