关于B型钠尿肽测定的质量要求

巩岩霞 王金良

2005年第3期的《临床化学》杂志发表了Apple等代表IFCC心脏标志物专家组关于B型钠尿肽测定的质量要求。此报告的目的在于改善B型钠尿肽（ΒNP）和其N端前肽(NT-BNP)的免疫化学测定法，要求将此报告的建议应用于商品试验的制造厂家，测定的临床试验室，临床验证和研究机构，也适用于管理机构，如美国的食品与药品管理局（FDA）。
此经循证医学过程形成的建议，要求：
（1）生产厂家依此建议坚持执行。
（2）关于BNP/NT－pro-BNP免疫分析试剂盒说明均应包括关于试验的设计，分析前的要求，分析性能特点和临床性能的信息。
（3）将每一试验的质量规格在有权威性杂志上发表。
（4）要求管理机构采用最低的和一致审核标准（依本建议）以便厂家在寻求批准或/和改进试验时能够提供。
建议只涉及此类标志物的应用，不涉及其生理和病理生理方面。
一．此建议中涉及的试验的含义
1.B型钠尿肽前体(pre-proBNP),指在心肌细胞中合成的细胞内前体，含134氨基酸，具26氨基酸的信号肽，只有心肌细胞中存在。
2.前钠尿肽(proBNP)指B型钠尿肽前体在释放信号的指令下去除26氨基酸的108氨基酸肽（1-108），存于心肌和血浆中。
3.B型钠尿肽(BNP)指具生物活性的前钠尿肽的C端（77-108氨基酸）片段，存于心肌和血浆中。
4.N端B型前钠尿肽(NT-proBNP)指前钠尿肽的N端（1-76氨基酸）片段，不具生物活性，存于心肌和血浆中，有时可进一步降解为1-21氨基酸片段，但对比片段的代谢和病理生理意义尚无资料。
二．建议的背景
B型钠尿肽试验的有效性必须通过最低的验证标准，这常需要满足FDA批准所需的试验（以及临床）性能，但建立参考范围，医学决定界限值以及分析特征（总的分析不精密度）则常不能满足分析和临床需要以便对患者各亚组做临床解释，其原因之一是缺少对新试验应一致遵循的，公认的最低质量规格。这样，新的或经改进的心脏标志物的商品化试验就缺少方法学上的一致性，会因试验性能的不同而造成临床医师，实验室和患者的误解，这些问题可通过比较同一试验的多种分析结果来解决。于是，两个检验医学工作组，即IFCC的心肌损伤生物标志物标准化工作组和美国临床生化学院心脏生物标志物工作组 拟定了循证医学的建议。此建议的目的是在权威杂志上发表以提供给厂家明确的分析和应用范例。最好管理机构，象FDA也能接受它作为510（K）对申请者批准的标准，只有确立适当的分析质量要求才能使：
1.临床上正确解释钠尿肽类的测定浓度。
2.减少由方法学差异而引起的结果不一致。
最终的目的是通过准确的测定和可信可理解的解释以利于患者。这要由国际上的实验室，厂家，临床医师和管理部门共同负起责任来完成。
三.分析中的问题
1.校准物的特性
对前BNP，NT-proBNP的合成与代谢的确切信息决定了试验中应用校准物的特性。已知BNP来源于BNP前体而去除N端的信号肽。它大多发生在心肌细胞表面，即释放入血以前，但血循环中也可发现少量完整的proBNP。这意味着在血循环中仍可发生酶解。Hunt等的研究更清楚地表明心力衰竭患者血浆中除BNP和NT-proBNP外，还有完整pro-BNP分子，这就涉及到血浆测定的特异性问题。
另一项研究指出，proBNP的N端区含有亮氨酸拉链样序列的要位（motif），它可介导在生理条件下的血浆中肽的寡聚合，生成proBNP的三聚体或四聚体以及NT-proBNP的三聚体。这些寡聚的分子可掩蔽或接触商品试验中抗体识别的表位。
研究资料提示血浆中蛋白酶可切割BNP，激肽激酶对C端结构的酶解发生在负电荷表面活化了凝血接触系统之后。这可在体内受损血管的内皮层表面发生，也可在体外因血液接触了玻璃采血管壁而发生，蛋白酶分解二个氨基酸N端残基，即丝氨酸和脯氨酸，可在采血后立即发生，也可在血循环中发生，使得BNP的N端更易于降解。故针对这些表位的试验及选用抗体就至关重要。近期的研究还表明，循环中的NT-proBNP为异质性，最具免疫反应性的NT-proBNP因两端被截短而明显地小于NT-proBNP１－７６，这一片段在血清中比血浆中更多。
为减低血浆中NT-proBNP的异质性，Goetze等建立了与处理无关的测定血浆中proBNP及其片段的方法。其校准物应用人工合成的proBNP1-14的酪氨酸延伸部位:抗体针对人proBNP1-10的序列。测定前用胰蛋白酶处理血浆以将全部proBNP酶降解为氨基酸序列1-21。此法克服了用不同的试验检测的是循环中的不同proBNP片段，其临床效用性尚待确定。现难以制成NT-proBNP(1-76)的校准物，故更倾向于应用可由单抗明确识别的短合成肽。在理论上，BNP和 proBNP可应用与患者标本相似的同序列校准物，但由于这些肽的异质性和各组分在液体中的明显差异性，故只能用患者标本所含物做测量校准物。虽然如此，校准物只能代表人体液中的“平均”物。对各种肽类在生理和病理条件下的释出和降解特点尚需明确证据，要明确循环中存在的是哪些肽片断，其中哪些最有临床应用性，在临床上含有何种改变。为此，建议：
(1)分析中的校准物应是最具临床应用性的分子。这需要国际上的循证研究来确定：（1）通过研究NP片断在各种生理和病理条件下的释放特征，明确循环中出现的片断。(2)为取得最大的临床应用性，应明确测定的片段。
(2)明确循环中各种NP片段的清除和降解机制。
(3)确定商品试验系等分子或非等分子地测定循环中的片段，这要了解商品试验中的抗体与循环中NT片段的亲合力。
(4)因尚不能溯源至SI单位，结果要用ng/l表示，而不用pmol/l。
所需的信息：
(1)校准物的来源与特征，如人源或动物源性，天然或重组物。
(2)校准物的分析性能，纯度和赋值的浓度。
(3)校准物曲线（曲线或直线反应性）和校准的点数。
2.试验的特异性
(1)BNP。已知最准确的BNP商品试验是夹心分析法，应用2种单抗或1单抗1多抗（表），经常是一个抗体与二硫键部位环状结构结合，另一抗体与BNP的C端或N端结合，BNP（氨基酸1-32）释入循环后，被酶在N端切去丝氨酸和脯氨酸残基，成为BNP3-32，此种降解会影响抗体对N端表位的亲和力。如今自心力衰竭患者血浆中尚未用HPLC法发现BNP1-32或3-32的进一步降解物。但不能排除标本自身的某些变化。二硫键部位的环状和C端结构在血中是稳定的。目前虽没有资料，但仍可能有变化。如有变化，此类抗体也能检出多聚体。
(2)NT-proBNP。FDA已批准二种夹心法测NT-proBNP 免疫分析法，已在世界上应用。尚有开发中的方法，多克隆抗体检测含氨基酸1-21和39-50的表位。在欧洲还应用一种竞争性酶免疫分析法，该法用的多抗针对proBNP的8-29氨基酸表位。如今，用HPLC法尚未从心衰患者血浆中检出完整（氨基酸1-76）分子的 NT-proBNP ，却发现循环中的免疫反应性NT-proBNP有明显的异质性。它们是两端截短后的肽。在理论上NT-proBNP应与proBNP有100%的交叉反应性，完整的proBNP也存于血浆中且可能发生寡聚合。
BNP和NT-proBNP测定对分析干扰的敏感性不同，来自嗜异性抗体的干扰如类风湿因子或人抗动物抗体（HAAAS）可导致错误结果。故试验设计应尽量避免此类干扰。在试验中加入生成抗体的动物的非免疫性血清可防止干扰。黄疸和溶血对以荧光为信号的试验会有干扰。有些分析仪则易受标本中颗粒物(如纤维蛋白丝)或气泡的干扰而产生错误结果。为此，建议：
(1)试验应避免与结构相关的物质有交叉反应（如心钠肽（ANP）,C型NP,利尿素，proANP，NT-proANP，NT-proANP的片段及其他肽类激素）。
(2)BNP试验应对BNP3-32有100%的交叉反应性。
(3)对proBNP/NT-proBNP的代谢和降解过程尚未搞清，对测定所应针对的表位尚无推荐意见，但最好是针对NT-proBNP的中段。
(4)BNP试验应明确所用抗体与proBNP及其多聚体的交叉反应性。
(5)应在抗体中加入类风湿因子或人抗动物抗体以明确它们对试验的干扰。在加入封闭剂或  用异嗜性抗体封闭管的前后进行测定。
所需的信息：
(1)试验中的抗体针对BNP/proBNP肽的确切表位特征。
(2)BNP和proBNP对BNP3-32以及所有NPS及其他肽激素的交叉反应性，包括proBNP及其多聚体。
(3)试剂中应规定所加的封闭性非免疫性血清或他种能中和嗜异性抗体和HAAS的封闭剂。
(4)明确有关的高浓度内源性干扰成分如血红蛋白，甘油三酯，胆红素，异常蛋白，对干扰的试验和统计学方法应有详细介绍。
3.试验的不精密度和检测限
测定BNP和NT-proBNP的各种试验的批内和总不精密度不同。自动化仪器要比手工法或POCT法为佳，不管在何处操作（在实验室或床边）均应有可接受的精密度。我们赞同Cotlove等提出的原则，即不精密度不能影响生物标志物的临床应用。理想的不精密度应是试验的CV值低于或等于个体生物变异的1/2，如此总CV(分析的加生物的)就不会高于个体间生物变异达12%。BNP和NT-proBNP均有高的生物变异，这与对其生理了解不够有关。有报告个体间CV可达30-50%，于是不精密度就不能再大。在治疗患者时需动态测定NP，也需尽量减低不精密度。
与不精密度相关的是检测限，即一定的试验可准确测定的最低浓度，其最低值应接近0。检测限也与临床应用有关，一般APS所需的检测限应低于健康人群参考值的四倍或五倍。为此，建议：理想的总不精密度（CV）在BNP/NT-proBNP浓度的参考区间对应<15%。
所需信息：
(1)确定不精密度，即给出逐步增高NP浓度下的CV%。要用NCCLS的EP5-A推荐的方法，用内含各种标志物人血清或血浆或全血的混合物来确定。标本既包括含量在参考区间者又有充血性心衰患者。
(2)确定检测限，即比不含BNP和NT-proBNP的标本（O校准物）所测均值（N=20，批内）高3SD的NP浓度。
4.BNP免疫分析的国际标准化
目前尚未实现BNP和NT-proBNP试验的标准化。不同试验间的差异源于所应用的肽校准物，抗体反应性的差异，抗体能否等分子地与抗体中待测物结合，标准化的目的在于使不同方法得出一致的值，能用同样的参考区间和决定界限值来诊断和处理患者。为此，建议
(1)要有适当的参考物质，即一级标准物和二级以血清为基质的参考物。
(2)要明确参考物质的一系列特征，包括来源，制作方法，基质，防腐剂和稳定剂及其适当的贮存方法。
(3)当用来给厂家的校准物赋值时，应确定所用的有证参考物的特征且应与血液中的分析物有共通性，如无基质效应等。
四．分析前的问题
BNP及相关肽的体外稳定性的资料甚少且有矛盾，采集血标本时即会发生蛋白酶降解，标本的稳定性与测定方法和测定的表位有关。用玻璃试管取血时外源凝血途径的激肽酶活化而使 BNP不稳定，但这也与测定方法所用的抗体性能有关。NT-proBNP在标本贮存过程中相对稳定。测定BNP,只能用EDTA抗凝。Elecsys NT-proBNP则只能用血清测定。用不同的方法测定血浆和血清中的NP会有差异。故对合适的抗凝剂应做周密研究，以便推荐。
NP(A,B,C型)是通过靶细胞表面的钠尿肽受体发挥效应的，已自人体组织分离出3种受体（A.B.C受体）NPS与NPR-A和B受体结合，可刺激内源性腺苷环化酶活性，生成细胞内信使cGMP。NPR-A受体在大血管最丰富，NPR-B受体存于脑内，NPR-C受体能与各NPS结合，部分负责NPS自循环中清除，NPS与受体结合而在原位酶解，经组织内吞饮而从循环中清除。中性内肽酶（NEPS）也参与NPS的降解，它是含锌的金属内肽酶，能在疏水氨基酸的氨基部位裂解底物。对NPS则是胱氨酸和苯丙氨酸（10和11位）连接处裂解。NEPS富含于肾的刷状缘膜，心肌细胞和内皮细胞，也能降解其他的循环中肽，如肾素，enkaphalin和神经紧张素。虽然NEPS也清除ANP，但其途径不如BNP重要。肾衰竭患者的NEPS可上调。
清除BNP的另一机制是肾小球滤过。慢性肾衰竭的BNP浓度增高。NT-proBNP无生物活性，不能与NPRS结合故不被NEPS降解。它的清除可能是由肾排出。肾衰竭患者的NT-proBNP明显升高，说明肾对其清除非常重要。但它的升高使血容量负荷加大，刺激NT-proBNP排泌，NT-proBNP的半衰期比BNP长，这就说明了NT-proBNP与测得的肾小球滤过率相比BNP有更好的相关性。NT-proBNP/proBNP可在尿中发现，肾小球滤过率减低时，其检出量升高。
测定proBNP的标本可存于室温24h，30℃为12h；EDTA血浆贮于4℃可稳定1月，如加有蛋白酶抑制剂aprotinin，时间会更长。中性内肽酶似乎不参与BNP的降解，故其体外的不稳定性是由于血清或血浆中的蛋白酶的作用。
NT-proBNP测定对标本贮存要求不严。血清，肝素抗凝血浆EDTA血浆在室温或4℃可稳定至少72h，标本贮存于-80℃可稳定1年，经5次反复冻融也无影响。用Roche的测定法，只有1篇报告提出肝素血浆与血清的差异有统计学意义，但未被证实。EDTA血浆与血清和肝素血浆相比会有恒定的负偏倚（平均6-10%），但未提及标本间的变化。为此，建议：
(1)测定BNP时，标本必需采在含EDTA的塑料管内，除非需用玻璃试管的特殊试验。测定NT-proBNP时，应用血清，如用抗凝剂时应先做比较（EDTA或肝素锂血浆与血清比较试验）。
(2)要研究标本的稳定性，在缺少此类研究情况下，BNP应在采集标本后放室温4h内测定。如4h内不能测定，应将标本离心，分离血清，加入激肽酶或丝氨酸特异性蛋白酶抑制剂，贮于4℃达72h，冻存（-70℃）可存更长期间。
(3)NT-proBNP在室温至少可稳定72h或存于4℃。
(4)两项试验标本均需要明确反复冻融的次数对测定稳定性的影响。
所需信息：
(1)明确标本管的成分，应标有制造商和批号。
(2)如用血浆测定，应说明抗凝剂的种类和浓度，应有数据和统计学说明对试验可能有的影响。
(3)试验标本在不同贮存温度下的体外稳定性应予说明。
(4)说明速凝管的分离胶对BNP和NT-proBNP测定浓度的影响。
五．临床重要性
BNP和NT-proBNP是在心室因负荷和室壁张力加大而释放，故血浆浓度的升高主要与心力衰竭，无症状性左房功能不良，动脉或肺高压，心肌肥厚，瓣膜性心脏病，心律不齐和急性冠脉综合症有关。两者均可在心脏或非心脏疾患时升高，故临床医师在解释检测结果时应谨慎。此两项指标也常包括在生物标志物的组合之内，如结合肌钙蛋白的结果，则可用来评价急性冠脉结合征的危险性。本推荐中未涉及年龄，性别，种族在各种疾患时的参考值和界限值，但在临床应用中必须解决。试图用单一界限浓度来做诊断，指导治疗或危险性评估，只有阐明了许多分析和临床应用中的问题，才是适宜的。
六．结论
对NPS做为处理心脏疾患的标志物的许多问题，实验室和临床应有如下共同的考虑:
(1)生物标志物的种类（BNP或NT-proBNP）
(2)它们的免疫学分析尚未标准化
(3)参考限的医学决定限会因人的年龄，性别而不同。
(4)NPS的个体生物变异很大
(5)具有诊断时间的窗口期（要适时监测）
(6)应用NPS的临床地点(门诊，急诊或冠心病监护病房)
(7)应用NPS的患者（肾衰竭或败血症等）
(8)是用于诊断还是用于预后指导及今后的治疗。

摘自:《检验诊断与实验室自动化》2005年5月刊