消毒技术规范（二）
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2007-2-8 14:14:50
2 消毒检验技术规范
2.1 消毒检验技术规范
2.1.1 消毒剂杀微生物试验技术
2.1.1.1 适用范围
本章内容主要适用于消毒剂鉴定和日常监测，用来评价各种用途的消毒剂对微生物的杀灭效果。按此方法进行的试验，只是对消毒剂的杀菌能力的重要方面进行验证，侧重反映消毒剂的实用剂量与杀菌能力。不能反映消毒剂的全面特性。
2.1.1.2 菌悬液与菌片的制备
2.1.1.2.1 适用范围
制备消毒剂杀菌试验用细菌悬液与菌片，以供消毒剂杀菌试验时使用。
2.1.1.2.2 试验器材
（1）菌种:金黄色葡萄球菌ATCC 6538，作为细菌繁殖体中化脓菌的代表；绿脓杆菌ATCC 15442，作为医院感染中最常分离的细菌繁殖体的代表；大肠杆菌8099，作为细菌繁殖体中肠道菌的代表；枯草杆菌黑色变种ATCC 9372，以其芽孢作为细菌芽孢的代表；龟分枝杆菌脓肿亚种ATCC 93326，作为人结核分枝杆菌的代表；白色葡萄球菌8032作为空气中细菌的代表。在上述规定的菌株基础上，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌株。
（2）有机干扰物：见附录A。
（3）磷酸盐缓冲液：见附录A。
（4）无菌蒸馏水。
（5）稀释液：见附录A。
（6）细菌培养基：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）等，见附录A。
（7）革兰染色液：见附录A。
（8）芽孢染色液：见附录A。
（9）恒温水浴箱。
（10）玻璃漏斗。
（11）刻度吸管（1.0ml、5.0ml、10.0ml），毛细吸管。
（12）数字可调移液器（10μl, 20μl, 100μl,200μl,1000μl）及配套用一次性塑料吸头。
（13）离心机。
（14）电动混合器
（15）浊度计。
2.1.1.2.3 细菌悬液制备程序
（1）细菌繁殖体悬液的制备
1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0 ml～10.0ml 营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37 ℃ 培养18h～24h。 用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于 37℃ 培养 18h～24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于 37℃ 培养 18h～24h，即为第3 代培养物。
2）取菌种第 3代～14 代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），用 5.0ml 吸管吸取 3.0 ml～5.0ml 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合（振荡）20s，或在手掌上振敲 80 次，以使细菌悬浮均匀。
3）初步制成的菌悬液，先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀释液稀释至所需使用的浓度。
4）细菌繁殖体悬液应保存在 4℃ 冰箱内备用。应当天使用不得过夜。
5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。
（2）细菌芽孢悬液的制备
1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量营养肉汤培养基，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5 ml～10ml 营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37℃ 培养 18h～24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于 37℃ 培养 18h～24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于营养肉汤培养基，于 37℃ 培养 18h～24h，即为第 3 代培养物。
2）用 5.0ml 吸管吸取 5.0 ml～10.0ml 第 3代～5代的 18h～24h 营养肉汤培养物，接种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面，将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基的表面，再将多余肉汤培养物吸出，置于37℃ 温箱内，培养 5d～7d。
3）用接种环取菌样少许涂于玻片上，固定后以改良芽孢染色法染色，并在显微镜（油镜）下进行镜检。当芽孢形成率达 95% 以上时，即可进行以下处理。否则，可再在室温下放置一定时间，直至达到上述芽孢形成率后再进行以下处理。
改良芽孢染色法：①用接种环取菌样涂布于玻片上，待自然干燥。而后通过火焰加热将菌固定于玻片上。②将涂片放入平皿内，片上放两层滤纸，滴加足量的 5.0% 孔雀绿水溶液。将平皿盖好，放54℃～56℃ 条件下，加热 30min。取出，去滤纸，用自来水冲洗残留孔雀绿溶液。③加0.5% 沙黄水溶液，染1min。水洗，待干后镜检。芽孢呈绿色，菌体呈红色。
4）罗氏瓶培养物，用 10.0ml 吸管加 10.0ml 无菌蒸馏水于每一罗氏瓶中，以 L 棒轻轻推刮下菌苔。 吸出第一批洗下的菌悬液，再向瓶内吸加 5.0ml 无菌蒸馏水，重复洗菌一遍。将第一和第二批洗下的菌悬液集中于一含玻璃珠的无菌三角烧瓶中，振摇5min，打碎菌块，使成均匀的芽孢悬液。
5）必要时，将盛装菌悬液的三角烧瓶置 45℃ 水浴中 24h，使菌自溶断链，分散成单个芽孢。
6）用无菌棉花或纱布过滤芽孢悬液，清除其中的琼脂凝块。
7）将过滤后的芽孢悬液，置无菌离心管内，以 3000 r/min 速度离心 30min。弃上清液，加蒸馏水吹吸使芽孢重新悬浮。再离心和重新悬浮清洗，先后共 3 遍。
8）将洗净的芽孢悬浮于三角烧瓶内蒸馏水中，并加入适量小玻璃珠。
9）将芽孢液放于 80℃ 水浴中 10min（或 60℃，30min），以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后，保存于 4℃ 冰箱中备用。有效使用期为半年。
10）芽孢悬液在使用时，应先进行活菌培养计数。
11）怀疑有杂菌污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。
2.1.1.2.4 菌片的制备程序
（1）消毒试验中使用的菌片是以菌液滴加于载体上制成。载体应根据消毒对象选择，常用的有金属、玻璃、滤纸、线、布等等。根据其特点选择适宜材料载体作为代表。载体可以为方形，大小为 10mm×10mm。 当以金属片为载体时，因方形金属载体在振敲时可将玻璃试管撞碎，故改用 12mm 直径圆形金属片（厚 0.5mm）。
（2）所用载体（除滤纸片外）于染菌前，应进行脱脂处理。脱脂方法如下：①将载体放在含肥皂的水中煮沸30 min；②而后以自来水洗净；③用蒸馏水煮沸 10min；④用蒸馏水漂洗至 pH 呈中性；⑤晾干（或熨平）备用。
（3）布片统一用白平纹棉布制作。在剪开前，先将脱脂的布块按载体规定的大小，抽去边缘一周的经纬纱各一根，再按抽纱痕剪开。此法制成的载体大小一致，且无毛边。金属片以不锈钢制作，纸片以新华滤纸制作。
（4）载体经压力蒸汽灭菌后，统一使用滴染法。
染菌用菌悬液：使用TSB营养肉汤配制。细菌繁殖体，可直接使用经18～24h培养的斜面培养物，细菌芽孢可使用4℃冰箱贮存液。含菌量约为1×108cfu/ml～5×108cfu/ml，可使用浊度计调整菌液浓度。
滴染法染菌时，将经灭菌的载体片平铺于无菌平皿内，逐片滴加菌液。菌液滴加量每片为10μl。用10μl移液器接灭菌塑料吸头，滴染菌液，并用接种环涂匀整个载体表面。滴染菌液后，染菌载体可置37℃温箱内烤干（约20min～30min），或置室温下自然阴干后再使用。注意细菌繁殖体在烤干过程中，可引起部分死亡，如绿脓杆菌在37℃烤干过程中，滴度最高可下降1个对数值。此时，应提高初始菌浓度，以便达到所需的菌量。
（5）每个菌片的染菌量，即回收菌数，按活菌培养计数所得结果，应为 5×105 cfu/片～5×106 cfu/片。
2.1.1.2.5 注意事项
（1）用浊度计测定的菌悬液浓度，只用于在滴染菌片时对菌悬液稀释度的估计。作为菌悬液含菌浓度或菌片染菌量的正式报告（如杀菌试验中阳性对照组菌悬液或菌片所含菌量），必须以活菌培养计数的实测结果为准，不得使用根据比浊法判定的估计值。
（2）制得的菌悬液和菌片，用毕应随时放入冰箱内，尽量减少在室温下放置时间，以免增加细菌的自然死亡。
（3）滴染时，菌液滴加量不宜过多，避免流散影响染菌的准确性。
（4）配制菌悬液和制备菌片时，保持环境的洁净和安静，严格按无菌要求操作，以防污染杂菌，影响随后杀菌试验的结果。
（5）用带橡皮塞的容器保存菌液时，应将其预先煮沸10min 进行脱硫处理。
2.1.1.3 活菌培养计数技术
2.1.1.3.1 适用范围
测定细菌悬液、菌片、采样液等样本中含有活菌的数量。
2.1.1.3.2 试验器材
（1）刻度吸管（1.0ml、5.0ml）。
（2）稀释液：见附录A。
（3）营养琼脂培养基：见附录A。
（4）电动混合器
2.1.1.3.3 操作程序
本规范要求在杀菌试验中的活菌培养计数统一使用倾注法。其操作程序如下。
（1）对菌悬液可直接进行培养计数。对菌片、采样棉拭与小型固体样本等，应将其上的细菌洗下成为菌悬液后进行培养计数。洗菌时，一般以稀释液为洗液。具体方法如下: 取含 5.0ml 稀释液无菌试管，对菌片或小型固体样本直接投入即可，对棉拭则将其采样端剪入管内，每管一份样本。而后，用电动混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80 次），将菌洗下形成菌悬液。以上操作应严格按无菌要求进行。
（2）将试管按需要数量分组排列于试管架上，每管加入 4.5ml 稀释液。各组由左向右，逐管标上 10-1、10-2、10-3......等。
（3）将菌悬液样本在用电动混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80次），随即吸取 0.5ml加至 10-1 管内。
（4）将 10-1 管依前法用电动混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80次），混匀，再吸取出 0.5ml 加入10-2 管内。如此类推，直至最后一管。 必要时，还可作某稀释度的1:1 或 1:4 稀释。
（5）选择适宜稀释度试管（以预计生长菌落数每平板为 30cfu～300cfu 者为宜），吸取其中混合均匀的悬液 1.0ml 加于无菌平皿内。每一稀释度接种 3个平皿。一般，需接种2个～3个不同稀释度。平皿加样前，应先按组编号，以免弄混。
（6）将冷至 40℃～45℃ 的熔化营养琼脂培养基，倾注于已加入样液的平皿中，每平皿 15ml～20ml。
（7）将平皿盖好，即刻轻轻摇动混匀，平放于台上。待琼脂凝固后，翻转平皿，使底向上，置 37℃ 温箱内培养。
（8）每日观察细菌生长情况。培养至规定时间（细菌繁殖体为 48h，白色念珠菌与细菌芽孢为 72h），计数最终结果的菌落数。
（9）对菌片和采样棉拭洗液的活菌培养计数，先按各试验要求处理（如去除残留消毒剂等），而后取其最终样液按上法进行培养计数。
（10）计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在30～300的平板为准，每个稀释度 3 个平板生长菌落数全合乎上述标准，则以该 3 个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符合上述标准，则以该合格的两个平板菌落的平均值为结果。
对估计菌量极少的样本（如消毒处理后样本），在培养计数时可不作稀释，即使平板菌落数未达 30 时，亦可用其计算最终结果。
将求得的平均菌落值，再乘以稀释倍数，即得每毫升原样液中的菌量。菌量单位为cfu。
2.1.1.3.4 活菌计数中技术操作误差的测定
试验者在活菌计数中因技术操作而引起的菌落数误差率（平板间、稀释度间）不宜超过10%。对误差率的自检，可按以下公式计算。
（1）平板间误差率计算公式：
（2）稀释度间误差率计算公式：
2.1.1.3.5 注意事项
（1）严格无菌操作，防止污染。
（2）认真检查试验器材有无破损（要特别注意试管底的裂痕和破洞），以防丢失样本和污染环境。
（3）注意菌液的均匀分散。
（4）稀释或取液时要准确，尽量减少吸管使用中产生的误差。
（5）每吸取一个稀释度样液，必须更换一支吸管，以减少误差。
（6）样液接种于平皿后应尽快倾注营养琼脂培养基，避免样液干燥于平皿上，影响结果的准确性。
（7）倾注时琼脂培养基温度不得超过 45℃，以防损伤细菌或真菌。倾注和摇动时，动作应尽量平稳，以利细菌分散均匀，便于计数菌落。勿使培养基外溢，以免影响结果的准确性和造成环境的污染。
（8）为提高试验成功率，最好先用浊度计对原菌液含菌量做出估计，尽可能在首次试验时所取的有限稀释范围内（2个～3个 稀释度）即有长菌在 30cfu～300cfu 之间的平板。
（9）结果计算时，必须弄清稀释倍数，以免计算错误。
2.1.1.4 残留消毒剂的去除方法
2.1.1.4.1 目 的
在化学消毒试验中，达到规定消毒时间终点时，要求立即终止残留消毒剂的继续作用，以便准确检测出消毒体系中残留存活的微生物及其数量。因为消毒体系中残留的消毒剂，可能对微生物的生长繁殖具有一定抑制作用，从而可导致对杀菌效果偏高的错误判断，甚至产生假阴性结果。残留消毒剂的去除（下简称除药），可排除残留消毒剂对微生物的抑制，从而使试验获得正确结果。
2.1.1.4.2 除药的原则
（1）可有效去除残留的消毒剂。
（2）对微生物无害，不减少微生物应有的回收量。
（3）不破坏培养基的营养成份，不影响其透明度。
（4）必须按规定方法进行鉴定试验，并认为合格者方可在相应的消毒试验中使用。
2.1.1.4.3 除药的方法
（1）化学中和法：又称中和剂法，是指在消毒剂与微生物作用到达规定时间的终点时，取样加于适宜种类和浓度的中和剂中，将残留消毒剂迅速中和，使其不再持续抑制或杀灭微生物的方法。本法同时含有稀释作用效果（至少1:1稀释，常用1:10稀释）。是最为普遍使用的方法。
对常用消毒剂，虽有一些中和剂介绍，但在实用中由于情况多变，效果不一定都理想。所以，在消毒试验前仍应将拟用中和剂按试验具体情况，经鉴定合格后再使用。
操作要点: ①对接触消毒剂的微生物样本，在达到规定作用时间，即刻取样移入鉴定合格的中和剂溶液中；②所用中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同；③即刻混匀，并按规定时间吸取样液进行随后的培养检测；④在将样本接种培养基以前的操作，应按规定时间内进行，以免微生物与中和剂或中和产物接触过久。
（2）过滤冲洗法
将经消毒剂作用过的微生物样本，立即加入适量稀释液中混匀（通过适量稀释，可减轻消毒剂的持续作用），并倾入装有微孔滤膜的滤器内，接真空泵抽吸过滤（或加压过滤）后，再加适量稀释液冲洗，同时过滤，可去除残留的消毒剂。多用于难以找到适宜中和剂的消毒剂试验中，如以植物提取物制备的消毒剂。本除药方法应按拟进行试验具体情况，经鉴定合格后再使用。
操作要点: ①准备好装有相应孔径微孔滤膜的滤器；②滤膜及滤器需先经灭菌处理；③初次过滤后，应使用一定量对微生物无害的稀释液进行冲洗，冲洗次数一般以洗净消毒剂为准；④最后一次冲洗、滤净后，将微孔滤膜以无菌操作法取出，进行随后的培养检测。
（3）稀释法
将经消毒剂作用过的微生物样本，用稀释液稀释，降低残留消毒剂浓度，以消除对微生物的抑制作用。但若稀释过多，微生物浓度下降，可出现假阴性结果。本法可单独使用，但更常见的是与其它方法同时使用。单独使用时，一般多用于浓度系数较高的消毒剂（如醇类消毒剂）。本法应按拟进行试验具体情况，经鉴定合格后再使用。
操作要点: ①对接触消毒剂的微生物样本，在达到规定作用时间后，即时以对微生物无害的稀释液稀释，稀释比例随试验需要决定；②磁力混合或敲打振荡，使之混匀；③吸取稀释样液进行随后培养检测。
2.1.1.4.4 注意事项
（1）处理时应严守无菌操作要求，所有试液须无菌，接触样本和试液的器材（如吸管、平皿、试管、滤材等）亦均须经灭菌，以免污染样本，影响试验结果。
（2）每次吸液，均须更换一支无菌吸管，以防交叉污染。此点由于操作繁琐，器材需求量大，往往不能认真执行，应加以注意。
（3）为保证试验的准确性，所用吸管的容量应尽量与拟吸取的液体量相近，不要用大吸管吸取少量液体；试验样本的混匀操作，必须认真进行；尽量减少中和剂或中和产物与试验微生物的接触时间。
（4）所用方法适宜与否，和消毒剂性质、复方中的附加成份、试验微生物种类、消毒试验种类等等均有关系，试验条件稍有改变就可能影响除药效果。故每进行一种消毒试验（包括消毒剂或微生物的更换），均需按规定对所选方法进行鉴定试验，合格者方可用于正式试验。此步骤绝不可省略，否则极有可能导致试验产生错误结果。
2.1.1.5 中和剂鉴定试验
2.1.1.5.1 目 的
确定所选中和剂是否适用于拟进行的细菌和真菌杀灭试验。
2.1.1.5.2 试验器材
（1）试验菌菌悬液和菌片（见 2.1.1.2）。
（2）刻度吸管（1.0ml、5.0ml）。
（3）小平皿（4 cm～6cm 直径）。
（4）恒温水浴箱。
（5）稀释液：见附录A。
（6）营养琼脂培养基：见附录A。
（7）电动混合器
2.1.1.5.3 试验设计原则
（1）通过所设各组试验结果综合分析，应可确定所用中和剂是否对测试消毒剂有良好的中和作用，对试验用细菌以及其恢复期培养是否有害或不良影响。
（2）在确定用何种中和剂进行鉴定试验有困难时，可对多个中和剂进行初选以确定（见本节文后【附】）。
（3）试验中所用消毒剂的浓度应以杀菌试验中使用的最高浓度为准。浓度过低，则不足以显示能否将高浓度消毒药物全部中和。
（4）鉴定试验中，消毒后去除残留消毒药物组（第2组）无菌生长，不能表明中和后细菌是否复苏。此时可适当缩短作用时间再试，但作用时间最短不得少于30s，否则难以控制试验的准确性。若缩短作用时间后仍无菌生长，在排除其他原因的基础上，可适当下调杀菌试验中消毒药物浓度，再次进行中和剂鉴定试验。
（5）同一消毒剂拟对多种微生物进行杀灭试验时，所用中和剂应按微生物种类分别进行鉴定试验，不得取代。对细菌繁殖体的试验，在大肠杆菌（8099）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、绿脓杆菌（ATCC 15442）中任选其一进行试验即可；对细菌芽孢，以枯草杆菌黑色变种（ATCC 9372）芽孢进行。
当用其他特定微生物进行杀灭试验时，均应以该特定微生物进行中和剂的鉴定试验。
（6）鉴定时根据所用杀菌试验方法，使用相应的悬液或载体定量试验。
【附】 中和剂初选试验
中和剂鉴定试验前，若难确定拟检测的中和剂，可通过本试验初选，而后以选中的中和剂进行正式的鉴定试验。初选操作程序如下：
（1）将 0.5ml 试验菌悬液（含菌量为 1×103 cfu/ml～5×103 cfu/ml）加入含 4.5ml 中和剂试管中，混匀，作用30min后，取1.0ml接种平皿，用营养琼脂倾注法培养。
（2）将 0.5ml 试验菌悬液（含菌量为 1×103 cfu/ml～5×103 cfu/ml）加入含 4.5ml中和产物试管中，混匀，作用30min后，取1.0ml接种平皿，用营养琼脂倾注法培养。
（3）试验同时设阳性对照组。阳性对照组以 0.5ml 菌悬液加入含 4.5ml 稀释液试管中，混匀，作用30min后，取1.0ml接种平皿，用营养琼脂倾注法培养。
当3组平板上长出的菌落数接近，如果以阳性对照组为标准（X），前两组长菌数为（X±50%X）以内，可选做进一步鉴定试验。
[ 注意：本试验虽为初选试验，但选中的中和剂95%以上均能通过正式的鉴定试验。如果初选出多种中和剂，则应依次进行正式鉴定试验，选其中效果最好者进行杀菌试验。若均未能通过正式鉴定试验，应设计新的中和剂，重新进行初选试验。]
2.1.1.5.4 试验分组
在细菌与真菌杀灭试验中所用除药方法的鉴定，至少应平行进行以下各组试验。
（1）消毒剂 + 菌悬液 → 培养
观察消毒剂对试验菌有无杀灭或抑制能力。
（2）（消毒剂 + 菌悬液） + 中和剂 → 培养
观察残留消毒剂被中和后试验菌有无复苏生长。
（3）中和剂 + 菌悬液 → 培养
观察中和剂是否抑菌。
（4）（消毒剂 + 中和剂）+ 菌液 → 培养
观察中和产物，或未被完全中和的残留消毒剂对细菌或酵母菌有无抑制作用。
（5）稀释液 + 菌悬液 → 培养
作为菌悬液阳性对照。
（6）稀释液 + 中和剂 + 培养基 → 培养
作为试验材料阴性对照。
2.1.1.5.5 中和剂悬液定量鉴定试验操作程序
根据试验分组，准备足量试管和平皿，依次进行编号。各组分别用适宜大小容量的无菌定量吸管按规定程序吸取或添加试剂和试验样本。
（1）第 1 组。吸取消毒剂 4.5ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，吸加 0.5ml菌悬液，混匀。作用至预定时间，吸此样液 0.5ml 加于含有 4.5ml 稀释液试管中混匀。吸取该最终样液1.0ml，接种于平皿中，做活菌培养计数。
（2）第 2 组。吸取消毒剂 4.5ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，吸加 0.5ml 菌悬液，混匀。作用至预定时间，吸此样液 0.5ml 加于含 4.5ml 中和剂溶液管中，混匀，作用 10min。吸取该最终样液 1.0ml，接种于平皿中，做活菌培养计数。
如平板生长菌落数均超过 300 个，应以稀释液对上述最终样液作适宜稀释后，再次进行活菌培养计数。
（3）第 3 组。吸取中和剂4.5ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中5min 后。再吸加 0.5ml 菌悬液，混匀。作用 10min。吸取该最终样液 0.5ml，用中和剂做 10 倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
（4）第 4 组。 吸取中和产物溶液 （以 1 份消毒剂加 9 份中和剂，作用 10min 配制而成）4.5ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中5min 后，再吸加 0.5ml 菌悬液，混匀。作用10min，吸取该最终样液 0.5ml，用中和产物溶液做 10 倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
（5）第 5 组。吸取稀释液 4.5ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中5min，再吸加 0.5ml 菌悬液，混匀。 作用 10min ，吸取该最终样液 0.5ml 用 稀释液 做 10 倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
（6）第 6 组。分别吸取稀释液与中和剂各1.0ml于同一无菌小平皿内，倒入上述试验同批次的培养基15ml～20ml，培养观察。如出现细菌生长，可能提示试验材料或操作过程中有污染。应重新进行试验。
2.1.1.5.6 中和剂载体定量鉴定试验操作程序
根据试验分组，准备足量试管和平皿，依次进行编号。各组分别用适宜大小容量的无菌定量吸管按以下程序吸取或添加试剂和试验样本。
（1）第 1 组。吸取消毒剂 5.0ml 于无菌小平皿内，将其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，用无菌镊子夹入一菌片，并使浸透于消毒液中。待作用至试验预定的时间，立即用无菌镊子取出菌片移入含 5.0ml 稀释液试管中，作用 10min。用电动混合器混合20s，或将试管振打 80 次，吸取该最终样液 1.0ml，接种于平皿中，做活菌培养计数。
（2）第 2 组。吸取消毒剂 5.0ml 于无菌小平皿内，将其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，用无菌镊子夹入一菌片，并使浸透于消毒液中，待作用至试验预定时间，立即用无菌镊子取出菌片移入含 5.0ml 中和剂试管中，用电动混合器混合20s，或将试管振打 80 次。作用 10min，吸取该最终样液1.0ml，分别接种于各平皿中，做活菌培养计数。
如平板生长菌落数均超过 300个， 应重新吸取该最终样液 0.5ml，用稀释液做适当稀释，选适宜稀释度悬液，吸取1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
（3）第 3 组。吸取中和剂 5.0ml 于无菌小平皿中，将其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，用无菌镊子夹入 1 菌片，并使浸透于中和剂内，作用 10min。 立即用无菌镊子取出菌片移入含 5.0 ml 中和剂试管中，用电动混合器混合20s，或将试管振打 80 次，混匀。吸取该最终样液 1.0ml，用中和剂做 10 倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
（4）第 4 组。 吸取中和产物溶液 （以浸有消毒剂的载体置 5.0ml 中和剂内，作用 10min） 5.0ml 于无菌小平皿内，将其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，用无菌镊子夹入 1 菌片，并使浸透于中和产物溶液中。作用 10min，用无菌镊子取出菌片，移入含 5.0ml 中和产物溶液的试管中，用电动混合器混合20s，或将试管振打 80 次，混匀。吸取该最终样液0.5ml，用中和产物溶液做 10 倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
（5）第 5 组。吸取稀释液 5.0ml 于无菌小平皿内，将其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后， 用无菌镊子夹入 1 菌片，并使浸透于稀释液中。作用10min，立即用无菌镊子取出菌片移入含 5.0ml 稀释液的试管中，用电动混合器混合20s，或将试管振打 80 次，混匀。吸取该最终样液0.5ml，用稀释液 做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，吸取 1.0ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
（6）第 6 组。分别吸取稀释液与中和剂各1.0ml于同一无菌小平皿内，倒入上述试验同批次的培养基15ml～20ml，培养观察。如出现细菌生长，可能提示试验材料或操作过程中有污染。应重新进行试验。
2.1.1.5.7 评价规定
试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格:
（1）第 1 组无试验菌，或仅有极少数试验菌菌落生长。
（2）第 2 组有较第 1 组为多，但较第 3、4、5（组）为少的试验菌菌落生长，并符合表 2-1 要求者。
表 2-1 中和剂鉴定试验合格标准中对第 1 组与第 2 组菌落数的要求
|
第 1 组平板平均菌落数 |
第 2 组平板平均菌落数 |
|
0 |
>5 |
|
X（1～10） |
>（X + 5） |
|
Y（>10） |
>（Y + 0.5 Y） |
注：对抑菌作用不明显消毒剂（如乙醇）所用中和剂的鉴定试验中，当第 1 组与第 2 组菌落数相近，难以达到本表要求时，可根据具体情况另行作出判断和评价。
（3）第 3、4、5（组）有相似量试验菌生长，并在 5×105 cfu/ml（片）～5×106 cfu/ml（片） 之间。其组间菌落数误差率应不超过 15%。第3、4、5 组间菌落数误差率计算公式其计算公式如下。
（4）第6组无菌生长。否则，说明试剂有污染，应更换无污染的试剂重新进行试验。
（5）连续 3 次试验取得合格评价。
2.1.1.5.8 注意事项
（1）试验所分各组均有其特定意义，不得任意删减。
（2）严守无菌操作，保持试液和器材的无菌，注意更换吸管，以防止沾染影响试验的准确性。
（3）在计算微生物浓度时，须考虑其稀释倍数。
（4）试验组序应按本规范所列排列。
2.1.1.6 物理法去除残留消毒剂的鉴定试验
2.1.1.6.1 目 的
通过本鉴定试验，确定常用的物理去除法是否可去除消毒体系中残留的消毒剂，使消毒剂鉴定试验显示出真正的杀菌效果。
2.1.1.6.2 试验器材
（1）过滤冲洗法需用经过灭菌处理的滤器、微孔滤膜、真空泵（或抽滤泵）。
（2）离心沉淀法需用离心机与离心管。
（3）吸附柱、分子筛柱（主要供病毒灭活试验用）。
（4）无菌稀释液、冲洗液。要求不应影响除药材料（如滤膜、吸附柱等）的性质，对微生物无伤害作用。常用的有：水、缓冲液（如PBS）、稀释液、含0.1%～0.5%吐温80的PBS、中和剂（可中和部分消毒成分）。
（5）其他器材随所用试验微生物而定。
2.1.1.6.3 试验设计原则
（1）通过所设各组试验结果综合分析，应可确定所选方法是否对测试消毒药物有良好的去除作用，对试验用微生物以及其恢复期培养是否有害或不良影响。
（2）试验中所用消毒剂的浓度应以杀菌试验中使用的最高浓度为准。浓度过低不足以显示能否将高浓度药物全部去除。
（3）鉴定试验中，消毒后去除残留消毒剂组无微生物生长，不能表明去除处理后细菌是否复苏。此时可增加处理时间或次数，亦可适当缩短作用时间再试。作用时间最短不得少于30s，否则难以控制试验的准确性。
（4）同一消毒剂拟对多种微生物进行杀灭试验时，所用物理除药法应按微生物种类分别进行鉴定试验，不得互相取代。对细菌繁殖体的试验，可在大肠杆菌（8099）、绿脓杆菌（ATCC 15442）或金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）中任选其一进行试验即可；对细菌芽孢，以枯草杆菌黑色变种（ATCC 9372）芽孢进行。
当用其他特定微生物 （如龟分枝杆菌脓肿亚种） 进行杀灭试验时，均应以该特定微生物再次进行除药方法的鉴定试验。
（5）鉴定中应根据正式杀灭试验的设计，选择使用悬液定量试验，还是载体定量试验。通常，悬液鉴定试验结果可用于载体试验。
2.1.1.6.4 物理去除方法的鉴定
（1）分组方法如下：
1）消毒剂 + 菌悬液 → 培养
观察消毒剂对试验菌有无杀灭或抑制作用。
2）（菌悬液 + 消毒剂） + 过滤冲洗法处理 → 培养
观察所用除药处理是否可使试验菌复苏生长。
3）（菌悬液 + 水） ＋过滤冲洗法处理 → 培养
观察除药处理是否影响试验菌的生长数量。
4）菌悬液 → 培养
将结果作为阳性对照值。
（2）操作程序如下：
1） 第 1 组。吸取消毒剂 4.5ml 于试管内，置 20℃±1℃水浴中 5min 后， 吸加0.5ml 菌悬液，混匀，作用至试验预定时间。吸取该最终样液0.5ml，加于含4.5ml 稀释液试管中，混匀。吸取最终样液 1.0ml 接种于平皿内，做活菌培养计数。
2） 第 2 组。吸取消毒剂 4.5ml 于试管中，置 20℃±1℃水浴中 5min 后，吸加 0.5ml 菌悬液，混匀。作用至试验预定时间，对其进行除药处理，并取最终样液 1.0ml 接种于平皿内，做活菌培养计数（如为滤膜法，可直接将滤膜有菌面朝上贴于平板表面）。如平皿生长菌落数均超过300 个，应再吸取该最终样液 0.5ml，用 PBS 做适当稀释，选择适宜稀释度悬液，吸取 1.0ml，分别接种于平皿内，做活菌培养计数。
3） 第 3 组。吸取稀释液4.5ml 于试管内，置20℃±1℃水浴 5min 后，吸加 0.5ml 菌悬液，混匀。不加消毒剂，做同上处理。取最终样液 0.5 ml 用稀释液做 10 倍系列稀释，选择 2个～3个适宜稀释度悬液，各取 1.0ml，分别接种于平皿内，做活菌培养计数（如为滤膜法，可先进行10 倍系列稀释，再经过滤冲洗法处理，然后直接将滤膜有菌面朝上贴于平板表面）。
4） 第 4 组。吸取试验菌悬液 0.5ml，置含 4.5ml 稀释液的试管中，不加消毒药物，亦不作任何除药处理，进行活菌培养计数，作为阳性对照值。
（3）评价规定
试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格:
1） 第 1 组无试验菌，或仅有极少数生长。
2） 第 2 组有远较第 1 组为多，但较第 3、4（组）为少的试验菌生长。在第 1 组无菌生长时，第 2 组平均每个平板 （或滤膜） 上生长菌落不少于 5 个。
3） 第 3、4 组测定的结果，微生物数量应在 5×105 cfu/ml～5×106 cfu/ml 之间， 其组间差不得超过两组回收菌数平均值的50%。组间差的计算可按下式进行:
4）连续 3 次试验取得合格评价。
5）本规范推荐使用过滤冲洗法。
2.1.1.6.5 注意事项 见 2.1.1.5.8。
2.1.1.7 细菌定量杀灭试验
2.1.1.7.1 目 的
在试验室内测定消毒剂杀灭悬液中或载体上细菌繁殖体和细菌芽孢所需剂量，以作为制定实用消毒剂量的参考。
2.1.1.7.2 试验器材
（1）按 2.1.1.2 所示方法制备的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和枯草杆菌黑色变种芽孢悬液或菌片。此外，根据消毒药物特定用途或试验特殊需要，准备其他菌种的悬液或菌片。
（2）消毒剂溶液除有特殊规定者外，应使用无菌硬水配制。消毒剂溶液浓度应以所含有效成份为准。例如，含氯消毒剂以所含有效氯浓度为准，碘伏以所含有效碘为准，过氧乙酸以所含过氧乙酸量为准，复方消毒剂浓度以主要杀菌有效成分的量为准。各组消毒剂溶液有效成份浓度的计算，应以菌药混合液中有效成份的最终浓度为准。
（3）去除残留消毒药物的中和剂或设备（经鉴定试验证实合格的中和,剂或有关器材）。
（4）消毒剂稀释用的硬水：见附录A。
（5）有机干扰物质。悬液试验用3%BSA溶液，载体试验直接用TSB(见附录A)。
（6）营养琼脂培养基：见附录A。
（7）刻度吸管（1.0ml、5.0ml）。
（8）恒温水浴箱。
（9）喷雾器（用于喷雾消毒试验）。
（10）电动混合器。
（11）秒表。
2.1.1.7.3 试验分组
试验中应分以下各组：
（1）试验组。按测试目的有两种选择。
第一种适用于消毒产品鉴定。根据所试菌种和消毒剂对该菌的杀灭能力，选定一株抗力较强的菌和一个消毒剂浓度（即产品使用说明书中指定的最低浓度）和 3 个作用时间（说明书指定最低作用时间，指定最低作用时间的一半，指定最低作用时间的一倍。如说明书指定最低时间为20min，则应进行10min、20min、40min 三个时间）进行试验。
第二种适用于消毒产品监督机构日常监测。根据所试菌种和消毒剂对该菌的杀灭能力，选定一株抗力较强的菌和一个消毒剂浓度和一个作用时间（说明书指定最低作用时间）进行试验。
（2）阳性对照组。根据各种试验的规定，用稀释液代替消毒剂溶液，按上述同样的步骤进行试验。所得结果代表菌液原有浓度，以其作为计算杀灭对数的初始浓度。
2.1.1.7.4 悬液定量杀菌试验操作程序
（1）首先按产品说明书要求配制消毒液。无特殊说明者，一律使用无菌硬水配制，配制的浓度为待测浓度的1.25倍（例如要评价的消毒液浓度为200mg/L，则应配制250mg/L），置20℃±1℃ 水浴备用。然后，按照2.1.1.2 配制实验用菌悬液，浓度为1×108cfu/ml～5×108cfu/ml,(实际作用时菌浓度为107cfu/ml。然后取消毒试验用无菌大试管，先加入0.5ml有机干扰物质，再加入0.5ml试验用菌悬液，混匀，置 20℃±1℃ 水浴中 5min后，用无菌吸管吸取上述浓度消毒液 4.0 ml 注入其中，迅速混匀并立即记时。
（2）待菌药相互作用至各预定时间，分别吸取 0.5ml 菌药混合液加于 4.5ml 经灭菌的中和剂中，混匀。
（3）各管菌药混合液经加中和剂作用 10min 后，分别吸取 1.0ml样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，但每管样液接种 2 个平皿即可。如平板上生长的菌落数较多时，可进行系列10倍稀释后，再进行活菌培养计数。
（4）同时用稀释液代替消毒液，进行平行试验，作为阳性对照。
（5）所有试验样本均在 37℃ 温箱中培养，对细菌繁殖体培养48h 观察最终结果；对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。
（6）试验重复3次，计算各组的活菌浓度 （cfu/ml），并换算为对数值（N），并按下式计算杀灭对数值:
杀灭对数值 (KL)＝对照组平均活菌浓度的对数值（No）－试验组活菌浓度对数值（Nx）
计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，最后一位数可以进行数字修约。
2.1.1.7.5 载体浸泡定量杀菌试验操作程序
（1）取无菌小平皿，标明所注入消毒液的浓度。按每片 5.0ml 的量，吸取相应浓度的消毒剂溶液注入平皿中。
（2）将盛有消毒剂平皿置 20℃±1℃ 水浴箱内 5min 后，用无菌镊子分别放入预先制备的菌片 3 片，并使之浸透于消毒液中。
（3）待菌药相互作用至各预定时间，用无菌镊子将菌片取出分别移入一含 5.0ml 中和剂试管中。用电动混合器混合20s，或将试管在手掌上振敲 80 次，使菌片上的细菌被洗脱进入中和液中，再放置5min以上，使中和作用充分。最终进一步混匀后，吸取 1.0ml 直接接种平皿，每管接种 2 个平皿，测定存活菌数。
（4）另取一平皿，注入 10.0ml 稀释液代替消毒液，放入 2 片菌片，作为阳性对照组。其随后的试验步骤和活菌培养计数与上述试验组相同。
（5）所有试验样本均在 37℃ 温箱中培养，对细菌繁殖体培养48h 观察最终结果；对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。
（6）试验重复 3 次 （包括对照），计算各组的活菌量（cfu/片），并换算为对数值（N），并按上节公式计算杀灭对数值。
2.1.1.7.6 载体喷雾定量杀菌试验操作程序
（1）根据所试菌种和消毒剂对该菌的杀灭能力，选定1个消毒剂浓度（即产品使用说明书中指定的最低浓度）和 3 个作用时间（说明书指定最低作用时间，指定最低作用时间的一半，指定最低作用时间的一倍。如说明书指定最低时间为20min，则应进行10min、20min、40min.三个时间）进行试验。
（2）选定消毒剂的浓度与作用时间。每种菌所染菌片应分开进行试验。试验时，每种载体菌片各取 3 片，以等边三角形或三角形阵列，均匀排布于一未沾有任何消毒剂的清洁无菌玻璃板上（如无菌平皿内）。
（3）每批试验以同一浓度消毒剂溶液对上述排列的菌片进行均匀喷雾。每次喷雾的距离和压力保持一致，以尽量使喷到菌片上的雾粒大小和数量一致。喷雾量以不使菌片湿透、流液为度。
（4）待菌药相互作用至各规定时间，取每种载体菌片 1 片，各放入一含 5.0ml 中和剂的无菌试管中。将试管用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲 80 次，使菌片上细菌被洗脱进入中和液中。
（5）吸取 1.0ml 上述洗液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，但每管接种 2 个平皿。
（6）每批试验均应换一块未沾有任何消毒剂的清洁无菌玻璃板。喷雾器换装新浓度消毒剂前，应将原残留消毒剂洗净，再换装新浓度消毒剂。
（7）用蒸馏水代替消毒液，按同样的喷雾方法进行处理，作为阳性对照组。如为压力罐装自动喷雾式气雾消毒剂，可直接用染菌载体作活菌计数，作为处理前阳性对照组。
（8）所有试验样本均在 37℃ 温箱中培养，对细菌繁殖体培养48h 观察最终结果；对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。
（9）试验重复 3 次，计算各组的活菌数（cfu/片），并换算为对数值（N），并计算杀灭对数值。
2.1.1.7.7 定量杀菌试验的评价规定
（1）产品监督检验，在产品说明书指定的浓度与最低作用时间，重复试验3次。要求定量杀灭悬液试验中，各次的杀灭对数值均≥5.00，可判定该产品消毒合格。但对载体定量杀灭试验，要求各次的杀灭对数值均≥3.00可判定消毒合格。
（2）产品申报卫生许可检验中，要求在产品说明书指定的浓度与3作用时间，重复试验3次。在产品指定浓度与最低作用时间，以及最低作用时间的一倍时，各次的杀灭对数均应达到消毒合格要求。在产品指定浓度与最低作用时间的一半时，可容许对不同细菌或在部分重复次数中，出现不合格结果。
（3）报告中应将各此试验的结果全部以表格的形式列出。阳性对照组应列出各次菌浓度，以及平均菌浓度。试验组应列出杀灭对数值，杀灭对数值大于5.00时，应表示为≥5.00，而不必列出具体的数字；杀灭对数值低于5.00时，应列出具体的数字（例如2.58，4.65）。
2.1.1.7.8 注意事项
（1）在杀菌试验中，每次均应设置阳性对照。
（2）试验中所使用的中和剂、稀释液和培养基等，各批次均应进行无菌检查，发现有菌生长，则全部试验需换用未污染试剂或培养基重做。
（3）悬液定量杀菌试验时，有机干扰物质一般采用3%（g/100ml）牛血清白蛋白贮存溶液，取0.5ml加入到消毒体系中（稀释10倍），进行消毒试验。如果某消毒剂说明书中指定，其产品只用于清洁物品或器械的消毒或只清洗消毒，可采用0.3%（g/100ml）牛血清白蛋白贮存溶液，取0.5ml加入到消毒体系中（稀释10倍），进行消毒试验。
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