消毒技术规范（三）
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2007-2-8 14:17:09
2.1.1.8杀灭分枝杆菌试验
2.1.1.8.1 目的
在实验室内测定消毒剂杀灭悬液中或载体上分枝杆菌所需剂量，以作为制定对分枝杆菌（包括结核杆菌）实用消毒剂量的参考。
2.1.1.8.2 试验器材
(1) 试验菌株 龟分枝杆菌脓肿亚种ATCC 93326
(2) 培养基 分枝杆菌干燥培养基(上海奥普生物医药有限公司)
(3) 试验菌及其菌悬液或菌片的制备（按 2.1.1.2所示方法制备）
(4) 中和剂 (根据 2.1.1.5 所示方法鉴定合格者)
(5) 稀释液 0.1% 胰蛋白胨的生理盐水溶液
(6) 消毒剂稀释用硬水：见附录A。
(7) 有机干扰物质：见附录A。
(8) 刻度吸管 (0.1ml、1.0ml、5.0ml)
(9) 恒温水浴箱
(10) 喷雾装置（用于喷雾消毒试验）
(11) 电力混合器。
(12) 计时装置。
(13) 培养箱
2.1.1.8.3 龟分枝杆菌脓肿亚种 ATCC 93326 菌悬液的制备
（1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量营养肉汤于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0 ml～10.0ml营养肉汤试管，滴入少许菌种悬液，置 37℃培养 18h～24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于分枝杆菌培养基平板上，于 37℃ 培养 72h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于分枝杆菌培养基斜面，于 37℃ 培养 72h，即为第3代培养物。
（2）取第3代～14代的分枝杆菌培养基斜面新鲜培养物（72h），用 5.0ml 吸管吸取 3.0 ml～5.0ml 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲 80次，以使细菌悬浮均匀。
（3）将制成的菌悬液，进行活菌培养计数（见 2.1.1.3），按其结果用稀释液稀释至所需浓度。
（4）菌悬液保存在4℃ 冰箱内备用。当天使用不得过夜。
2.1.1.8.4 试验分组
试验分为下列各组:
(1) 试验组,按 2.1.1.7.3 规定，选定消毒剂浓度与作用时间。
(2) 阳性对照组, 以稀释液代替消毒剂溶液,按 2.1.1.7.3 规定程序进行试验。所得结果代表试验体系中所含受试菌的初始浓度，并以其计算消毒因子对受试菌的杀灭对数值。
(3) 阴性对照组,观察同次试验用相关溶液和培养基有无污染。
2.1.1.8.5 试验程序
常用杀灭试验有: 悬液定量杀灭试验、载体浸泡定量杀灭试验、载体喷雾定量杀菌试验等。其操作程序详见 2.1.1.7.4,2.1.1.7.5,2.1.1.7.6。
活菌培养计数时, 在 37℃ 中培养1周， 观察最终结果。
2.1.1.8.6 评价规定
(1) 产品监督检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和作用时间，重复试验 3 次 ，各次试验的杀灭对数值均 3 5.00 ,可判定该产品对分枝杆菌污染物消毒合格。
(2)产品鉴定检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和 3 个作用时间，重复试验 3 次，在产品规定使用浓度与最低作用时间，以及最低作用时间的一倍时，各次试验的杀灭对数值均应 3 5.00,在产品规定使用浓度与最低作用时间的一半时，在3 次试验中允许有一次试验对数值 < 5.00，可判为实验室试验该产品对分枝杆菌污染物消毒的有效剂量。
2.1.1.9 真菌杀灭试验
2.1.1.9.1 目的
在实验室内测定消毒剂杀灭悬液中或载体上真菌繁殖体或真菌孢子所需剂量，以作为制定实用消毒剂量的参考。
2.1.1.9.2试验器材
(1) 麦芽浸膏琼脂（MEA）：见附录A。
(2) 沙堡琼脂培养基：见附录A。
(3) 试验菌及其菌悬液或菌片的制备
白色念珠菌ATCC 10231 和黑曲霉菌ATCC 16404 或孢子悬液与菌片按 2.1.1.9.3(1) 和 2.1.1.9.3(2) 所示方法制备。
此外，根据消毒剂特定用途和特殊需要，可选用其它真菌或孢子悬液与菌片。
(4) 中和剂 (根据 2.1.1.5 所示方法鉴定合格者)。
(5) 磷酸盐缓冲液( PBS, 0.03 mol/L,pH7.2)。
(6) 消毒剂稀释用硬水：见附录A。
（7）有机干扰物质：见附录A。
(8) 刻度吸管 (0.1ml、1.0ml、5.0ml)。
(9) 恒温水浴箱。
（10）喷雾装置（用于喷雾消毒试验）。
（11）电动混合器。
（12）计时装置。
2.1.1.9.3 真菌悬液制备
（1）白色念珠菌悬液的制备
1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量沙堡液体培养基于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0 ml～10.0ml 沙堡液体培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37℃培养 18h～24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于沙堡琼脂培养基平板上，于 37℃ 培养 18h～24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于沙堡琼脂斜面，于 37℃ 培养 18h～24h，即为第 3 代培养物。
2）取第3代～14代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），用 5.0 ml 吸管吸取 3.0 ml～5.0ml 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲 80次，以使白色念珠菌菌悬浮均匀。
3）菌悬液的含菌量和菌片制备按2.1.1.2 要求进行。
4）菌悬液保存在 4℃ 冰箱内备用。当天使用不得过夜。
5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。菌落形态可直接用显微镜观察。菌体形态可在涂片后直接用高倍显微镜观察，也可用墨水阴地法染色（将菌与黑墨水在玻片上混匀，推成薄膜）后观察。
（2） 黑曲霉ATCC 16404 悬液或菌片的制备。
1) 在无菌操作下打开冻干菌种管，以毛细管吸取少量麦芽浸膏营养肉汤培养基加到菌种管中，轻轻吹吸，使菌种沉淀物融化分散。取少许沉淀物悬液加到含 5.0ml 麦芽浸膏营养肉汤培养基试管中，置 30℃±1℃ 培养 42h～48h。用接种环划线接种第 1 代培养物于 MEA 培养基平板，置 30℃±1℃ 培养箱中培养 42h～48h。取平板培养物中的典型菌落，接种于麦芽浸膏营养肉汤培养基，置 30℃±1℃培养箱中培养 42h～48h，即为第3代培养物。
2) 用10.0ml 吸管吸取5.0 ml～10.0ml 第 3 代培养物，接种罗氏瓶，并摇动使菌液布满 MEA 培养基表面，然后将多余肉汤培养物液体吸出，置 30℃±1℃ 培养 42h～48h。
3) 向罗氏瓶培养物中加入5.0 ml～10.0ml 0.05%（V/V）吐温 80 生理盐水溶液, 刮洗黑曲霉分生孢子于溶液中，将孢子悬液移入装有玻璃珠的三角瓶中，轻轻振摇 1min 后,滤过除去菌丝。滤过后，显微镜下（400 倍）观察是否存在菌丝，若悬液中有菌丝存在，可经 5000 r/min～6000 r/min，离心 20min。再次在显微镜下（400 倍）观察，若悬液中仍有菌丝存在，须再离心。
4) 黑曲霉分生孢子悬液在 2℃～8℃ 储存不能超过 2 d，使用前，混合均匀，在显微镜下（400 倍）观察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，则弃之不用。
5) 使用时，可用稀释液适当稀释。
6) 制备染菌样片时染菌方法为滴染法,每片加菌悬液10μl。染菌后，置 37℃ 培养箱内烤干(约 30min)，或置室温下自然阴干后再使用。
7) 回收菌数应达5×105cfu/片～5×106cfu/片，可依试验要求确定。
2.1.1.9.4 试验分组
试验分为下列各组:
(1) 试验组,按 2.1.1.7.3 规定，选定消毒剂浓度与作用时间, 对受试菌种的杀灭能力进行测定。
(2) 阳性对照组, 以稀释液代替消毒剂溶液,按 2.1.1.7.3 规定程序进行试验。所得结果代表试验体系中所含试验菌的初始浓度，并以其计算消毒因子对试验菌的杀灭对数值。
(3) 阴性对照组,观察同次试验用相关溶液和培养基有无污染。
2.1.1.9.5 试验程序
常用杀灭试验有: 悬液定量杀菌试验、载体浸泡定量杀菌试验、载体喷雾定量杀菌试验等。其操作程序详见 2.1.5.4, 只是培养基对白色念珠菌为沙堡葡萄糖琼脂，对黑曲霉菌为麦芽浸膏琼脂（MEA）。
活菌培养计数时, 对白色念珠菌，在 37℃ 培养箱中培养72h 观察最终结果。对黑曲霉菌，在30℃ 培养箱中培养 72h 观察最终结果。
2.1.1.9.6 评价规定
(1) 产品监督检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和作用时间，重复试验 3 次 ，对白色念珠菌和黑曲霉菌各次试验的杀灭对数值均 ≥5.00,可判定该产品对真菌污染物消毒合格。对所试特定真菌的杀灭对数值均 ≥ 5.00,可判定该产品对特定真菌污染物消毒合格。
(2) 产品申报卫生许可检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和 3 个作用时间，重复试验 3 次，在产品规定使用浓度与最低作用时间，以及最低作用时间的一倍时，各次试验的杀灭对数值均应 ≥5.00,在产品规定使用浓度与最低作用时间的一半时，3 次试验中允许有一次试验杀灭对数值应< 5.00，可判为实验室试验该产品对真菌污染物消毒的有效剂量。
用载体浸泡定量杀菌试验评价杀菌效果时，在产品规定使用浓度与最低作用时间，以及最低作用时间的一倍时，各次试验的杀灭对数值≥3.00，在产品规定使用浓度与最低作用时间的一半时，3次试验中允许有一次试验杀灭对数值应<3.00，可判为实验室试验该产品对真菌污染物消毒的有效剂量。
2.1.1.9.7 注意事项
(1) 黑曲霉菌试验操作应在 Ⅱ 级生物安全柜内进行，避免造成环境污染和操作者受污染。
(2) 其它注意事项见 2.1.1.7.8。
2.1.1.10 病毒灭活试验
2.1.1.10.1 适用范围
本章内容主要适用于消毒产品鉴定或日常监测。用具有一定代表性的、活的病毒及其细胞感染技术，评价各种用途的消毒因子对测试病毒的杀灭效果。按此方法进行的试验，只是对消毒因子的灭活病毒能力的重要方面进行验证。
2.1.1.10.2 试验器材
（1）试验用病毒株：脊髓灰质炎病毒1型（poliovirus-Ⅰ，PV-Ⅰ）疫苗株；艾滋病病毒 1 型（HIV-1）美国株。
（2）宿主细胞：可采用VERO细胞系、BGM细胞、Hela细胞系或FL细胞系，作为PV-1疫苗株的测试细胞。用含有人T 淋巴细胞白血病病毒 1 型（human T cell leukemiavirus 1，HTLV-1）基因的人淋巴细胞（MT4 株）作为HIV-1的测试细胞。
（3）细胞培养瓶与 96 孔培养板。
（4）恒温水浴箱。
（5）二氧化碳培养箱。
（6）层流超净工作台。
（7）低温冰箱（-20℃，-80℃）。
（8）液氮罐。
（9）倒置显微镜。
（10）离心机。
（11）可调移液器及配套一次性塑料吸头。
（12）细胞维持培养基：见附录A。
（13）细胞完全培养基：见附录A。
（14）去离子水。
2.1.1.10.3 病毒悬液的制备
（1）从液氮中取出冻存的试验用宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，用毛细吸管移植含有细胞维持液的细胞管内，吹吸数次，使混匀，立即离心（3000r/min,3min），去上清液。再加入适当的细胞维持液，吹吸数次，使混匀，同上离心后，转种于加有10ml完全培养基的培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于消毒试验。
（2）取出低温冻存的试验病毒毒种，37℃水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃温箱中，使与细胞吸附、生长。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。
（3）收获后，将含有病毒及宿主细胞的培养液，在冰浴条件下，用超声波（或反复冻融）破碎宿主细胞，释放病毒。然后，尽快离心（6000r/min,15min）去除沉淀（主要为细胞碎片），上清液即为所需的病毒悬液。按每管1.0ml分装于无菌离心管(1.5ml)中。
（4）取1支病毒悬液，按病毒滴度测定法，测定其病毒滴度。其余均冷冻保存于-80℃备用。
2.1.1.10.4 病毒灭活滴度计算方法
（1） 终点稀释法病毒感染滴度的计算
以半数细胞感染剂量（TCID50）表示。TCID50的对数值计算公式如下。
TCID50 对数值= 病变率高于50%组稀释度的对数值 + 距离比例
（“病变率高于 50% 组”是指病变率超过50%的最低组，下简称“高于 50% 组”；“病变率低于50%组”是指病变率低于50%的最高组，下简称“低于50%组”）。
具体计算方法如下：
1）计算细胞病变率。先计数培养板上不同稀释度样本细胞病变发生与未发生的孔数，然后分别计算“细胞病变（-）”和“细胞病变（+）”的累积总计值。计算“细胞病变（-）”累积值时，由稀释度低样本组向稀释度高样本组累积；“细胞病变（+）”累积值则相反，由稀释度高样本组向稀释度低样本组累积〔见表 2-2〕。
各稀释度样本组“细胞病变（+）”累积总计值，除以该稀释度样本组“细胞病变（-）”与“细胞病变（+）”累积总计值之和即为其病变比，由之可得病变率（%）〔见表 2-2〕。
2）计算距离比例。距离比例可按下式计算：
3）计算举例
设试验数据如表 2-2
表 2-2 某消毒剂对 HIV 灭活作用的测定结果
|
样本 |
接种 |
细胞病变 |
累积值 |
病变比 |
病变率（%） | ||
|
稀释度 |
孔数 |
- |
+ |
细胞病变(-) |
细胞病变(+) | ||
|
10-4 |
4 |
0 |
4 |
0 |
12 |
12/12 |
100 |
|
10-5 |
4 |
0 |
4 |
0 |
8 |
8/8 |
100 |
|
10-6 |
4 |
1 |
3 |
1 |
4 |
4/5 |
80 |
|
10-7 |
4 |
3 |
1 |
4 |
1 |
1/5 |
20 |
|
10-8 |
4 |
4 |
0 |
8 |
0 |
0/8 |
0 |
本例，高于 50% 组病变率（%）为80；低于50%病变率（%）为20；高于50%组稀释度对数值为 6。
TCID50 对数值 = 6＋0.5 = 6.5
（2）噬斑法病毒感染滴度的计算
噬斑法病毒感染滴度，以噬斑形成单位数（pfu），简称噬斑数表示。计数方法同活菌培养计数技术（参见2.1.1.3）。
每毫升测试样品中的病毒含量计算（pfu/ml）＝ 平板平均噬斑数×稀释倍数
（3）平均灭活对数值的计算
平均灭活对数值按下式计算：设阳性（病毒）对照组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）的为N0，试验（消毒）组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）为Nx。
平均灭活对数值 = ㏒ N0 ― ㏒ Nx
2.1.1.10.5 残留消毒剂化学中和法的鉴定试验
（1）目 的
本鉴定试验只在确定所选中和剂是否适用于拟进行的细胞感染法病毒灭活试验。
（2）试验设计原则
1） 通过所设各组试验结果综合分析，应可确定所用中和剂是否对测试消毒药物有良好的中和作用，对试验用病毒和细胞株是否有害或不良影响。
2） 根据试验目的，选择适宜的病毒株和细胞株。
3） 中和试验用药物浓度应为正式消毒试验最高浓度。作用时间最短不得少于30s。
（3）试验分组
在使用细胞感染法进行病毒灭活试验时，对所用中和剂的鉴定，应进行以下各组试验。其中，先进行预备试验中的第 1组～3 组试验，如中和剂与中和产物对细胞生长无影响，再进行以下的正式试验。
预备试验:
1）中和剂 + 细胞 → 培养
观察所用中和剂对细胞的生长有无影响。
2）（消毒剂 + 中和剂）+ 细胞 → 培养
观察中和产物溶液对细胞生长有无影响。
3）（消毒剂 + 细胞）→培养
观察消毒剂对细胞生长有无影响。
正式试验:
1）消毒剂 + 病毒悬液 → 接种细胞培养
观察所试消毒剂对病毒有无抑制或灭活作用。
2）（消毒剂 + 病毒悬液） + 中和剂 → 接种细胞培养
观察残留消毒剂被去除后，病毒是否可恢复对细胞的感染作用。
3）中和剂 + 病毒悬液 → 接种细胞培养
观察中和剂对病毒有无抑制作用。
4）（消毒剂 + 中和剂） + 病毒悬液 → 接种细胞培养
观察中和产物，或未被完全中和的残留消毒剂对病毒有无抑制作用或对检测方法有无干扰。
5）病毒悬液 → 接种细胞培养
观察病毒是否可正常生长，并将其结果作为阳性对照值。
6）未接种病毒的细胞 → 培养
观察其生长是否正常。
（4）病毒悬液定量法中和剂鉴定试验操作程序
根据试验分组，准备足量有关器材，依次摆放，进行编号。各组分别用适宜大小容量的无菌定量吸管按以下程序吸取或添加试剂和试验样本。各组每吸一次试剂或样本，即应更换一次吸管或微量移液器吸头，以防相互污染。
1） 预备试验第 1 组。 将试验用细胞，分别加入不同稀释度的中和剂溶液，作用3 h～4h 后，吸去液体，另加细胞维持培养液，置37℃ 二氧化碳培养箱中培养。
2）预备试验第 2 组。将试验用细胞， 分别加入不同稀释度中和产物溶液作用3h～4 h 后，吸去中和产物溶液，另加细胞基础培养液，置 37℃ 二氧化碳培养箱中培养。
3）预备试验第 3 组。将试验用细胞，分别加入不同稀释度的消毒剂，作用 3h～4h后，吸去消毒剂，另加细胞维持培养液，置 37℃ 二氧化碳培养箱中培养。
4）正式试验第 1 组。 吸取双倍浓度消毒剂溶液 0.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后，吸加 0.5 ml 病毒悬液，混匀。待作用至试验预定的灭活病毒时间，加入1.0ml去离子水，根据试验规定量，吸取该最终样液 （或以对病毒无害的稀释液作系列稀释），进行随后的病毒滴度测定。
5）正式试验第 2 组。 吸取双倍浓度消毒剂溶液 0.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后，再吸加 0.5 ml 病毒悬液，混匀。待作用至试验规定的灭活病毒时间，加入 1.0 ml 中和剂溶液，混匀，作用 10 min。进行随后的病毒滴度测定。
6）正式试验第 3 组。吸取 0.5 ml 去离子水于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后，再吸加 0.5 ml 病毒悬液，混匀。待作用10 min，加入 1.0 ml 中和剂溶液，混匀。进行随后的病毒滴度测定。
7）正式试验第 4 组。吸取双倍浓度消毒剂 0.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后，加入 1.0 ml 中和剂，再吸加 0.5 ml病毒悬液，混匀，作用 10 min。进行随后的病毒滴度测定。
8）正式试验第 5 组。吸取去离子水 1.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后，再吸加 0.5 ml 病毒悬液，混匀。进行随后的病毒滴度测定。
9）正式试验第 6 组。将试验用细胞，加细胞维持培养液后，置37℃ 二氧化碳培养箱中培养。
10）本试验中对各种病毒的接种和检测操作技术，若无特殊要求，按病毒学中各种病毒的常规培养和检测方法进行即可。
（5）评价规定
试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格:
1） 正式试验中第 1 组无试验病毒，或仅有少量试验病毒生长。
2） 正式试验中第 2 组有较第 1 组显著为多，但较第 3、4、5（组）显著为少的试验病毒生长。
3） 正式试验中第 3、4、5（组）病毒生长与原接种量相近。
4） 正式试验中第 6 组细胞生长正常。
5） 预备试验结果显示，中和剂和中和产物，在正式试验的最高浓度下对细胞生长无影响。
6） 连续 3 次试验取得合格评价。
（6）注意事项
病毒载体中和试验法可参照上述悬液定量中和试验程序，并按照病毒学原理进行适当修改后使用。
2.1.1.10.6 残留消毒剂物理去除方法的鉴定试验
病毒灭活试验中的物理除药法，首先稀释法，其次为吸附柱法、分子筛柱法、载体冲洗法。
（1）分 组
1）消毒剂 + 病毒悬液 → 接种培养
观察所试消毒剂对病毒有无灭活或抑制作用，对细胞正常生长有无影响。
2）（消毒剂 + 病毒悬液） + 除药处理 → 接种培养
观察去除残留药物后病毒可否恢复对细胞的感染作用。
3）病毒悬液 + 除药处理 → 接种培养
观察除药处理对病毒滴度有无影响。
4）病毒悬液 → 接种培养
观察病毒生长是否正常，并以该结果作为阳性对照值。
5）未接种病毒的细胞 → 培养
观察细胞生长是否正常。
（2）悬液定量操作程序
1）第 1 组。吸取消毒剂 0.9ml 于试管内，置 20℃±1℃水浴中经 5min 后，吸加 0.1ml 病毒悬液，混匀。待作用至试验规定的灭活病毒时间，根据试验规定量，吸取该最终样液（或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。
2）第 2 组。吸消毒剂 0.9ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中经 5min 后，吸加 0.1ml 病毒悬液，混匀。待作用至规定的时间，对此液进行除药处理，根据试验规定量，吸取最终样本（或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。
3）第 3 组。吸取病毒悬液 0.1ml，加 0.9ml细胞基础培养液，做除药处理。根据试验规定量，吸取最终样本（或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。
4）第 4 组。吸取病毒悬液 0.1 ml， 加细胞维持液 0.9ml，不加消毒剂亦不做任何除药处理。根据试验规定量，吸取该病毒悬液（或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。
5）第 5 组。向未接种病毒的细胞管内，加入完全细胞培养基培养。
（3）评价规定
试验结果符合以下全部条件，所测物理除药法可判为合格:
1）第 1 组无试验病毒，或仅有少量生长。
2）第 2 组有远较第 1 组为多，但明显较 3组～5组为少的试验病毒生长。
3）第 3、4、5 （组）试验病毒生长量相近。
4）连续 3 次试验取得合格评价。
5）可使用病毒载体，按同样的原理与操作步骤进行试验，判定合格标准相同。
2.1.1.10.7 脊髓灰质炎病毒灭活试验
（1）目的
在试验室内测定消毒剂对脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，PV）灭活所需的剂量，作为制定病毒污染物消毒实用剂量的依据。
（2）实验原理
用细胞感染法测定消毒剂作用前后（或实验组与对照组）样本中脊髓灰质炎的量。以细胞病变作为判断指标，确定各组病毒的感染滴度，计算消毒剂对脊髓灰质炎的灭活率。
（3）试验分组
1）试验组。根据所测消毒剂对其他微生物的杀灭或灭活剂量估计，设定适宜的浓度与作用时间组（不少于1个浓度，3个作用时间），对作用时间的设计应不短于30s。
2）阳性对照组。用去离子水代替消毒剂，按试验组规定步骤加入脊髓灰质炎悬液进行试验和培养，观察脊髓灰质炎生长是否良好。
3）阴性对照组。用不含脊髓灰质炎的完全培养基作为阴性对照，观察所用培养基有无污染，细胞是否生长良好。
（4）脊髓灰质炎悬液定量灭活试验操作程序
1）从液氮中取出冻存的试验宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，并用细胞维持液洗涤两次后，转种于加有10ml完全培养基培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于消毒试验。
2）取出低温冻存的脊髓灰质炎-1毒种，37℃水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后接种于含已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃温箱中，使与细胞吸附、生长。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。收获时，将培养液取出，用超声波或反复冻融破碎宿主细胞，尽快离心，并将含病毒的上清液按每管1.0ml分装于无菌离心管（1.5ml）中，冷冻保存于-80℃备用。
3）取待测消毒剂，用灭菌硬水稀释至所需浓度的1.25倍，于20℃±1℃水浴中备用。
（4）取100μl有机干扰物质与100μl病毒原液混合，于20℃±1℃水浴中作用5min，加入0.8ml待检消毒剂，立即混匀并记时。作用规定时间，立即取出0.1ml，加入合格中和剂中混匀；或用经鉴定合格的除药方法处理。
5）阳性（病毒）对照组试验中，用无菌去离子水代替消毒剂。
6）各组分别进行病毒滴度测定，可采用终点稀释法或噬斑法进行。
7）试验重复3次。
8）终点稀释法操作步骤：先用细胞维持培养液对待滴定样本做10倍系列稀释，然后在96孔培养板上滴定各稀释度样本中残留的病毒量，每个稀释度做4孔（各孔中应该已经长满单层的宿主细胞），在37℃，放置1h～2h，以确保残留病毒全部吸附在细胞上。取出培养板，更换细胞维持培养液。继续放入二氧化碳培养箱中（37℃，5%CO2）培养，逐日在显微镜下观察细胞病变，连续观察3d，逐孔观察并记录细胞病变情况。
终点稀释法病毒感染滴度的计算：以半数细胞感染剂量（TCID50）表示。
9）噬斑法操作步骤：先用细胞维持培养液对待滴定样本做10倍系列稀释，然后接种于细胞培养瓶中，滴定各稀释度样本中残留的病毒量。
接种细胞前，将生长致密的单层细胞中的培养液倾出，加入1ml待测样品，放置37℃吸符1h～2h，倾出样液，加入含0.8%琼脂的细胞维持液3ml，冷却后翻转细胞瓶， 放置37℃培养48h～72h。然后每瓶细胞加入2ml甲醛溶液固定数分钟， 用自来水冲洗后加结晶紫溶液染色数分钟，冲洗干净后计数。细胞瓶内圆形不着色的透明区即为一个蚀斑单位，每毫升测试样品中的病毒含量计算：
pfu/ml＝平板平均蚀斑数×稀释倍数
注意：为了便于计数，病毒蚀斑数一般控制在每细胞瓶10pfu～30pfu。
（5）平均灭活对数值的计算
平均灭活对数值按下式计算：设阳性（病毒）对照组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）的为N0，试验（消毒）组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）为Nx。
平均灭活对数值 = ㏒ N0 ― ㏒ Nx
（6）评价规定
1）脊灰病毒灭活试验，可用于评价医疗器械、食具、物体表面和皮肤用化学消毒剂对病毒的灭活效果。病毒的灭活滴度，应达到4个对数值。
2）在正常情况下，3次试验的平均灭活对数值≥4.00，可判为对脊髓灰质炎病毒污染物消毒的实验室试验合格。同时，阳性对照组病毒滴度对数值应在5～7 之间。
（7）注意事项
1）操作人员应具有基本的病毒学实验工作经验，尽量使用移液器与无菌一次性吸头。
2）在杀菌试验中，每次均应设置阳性对照。
3）如使用病毒载体进行试验，可参照上述悬液定量试验程序，并遵照病毒学原理进行适当修改后使用。
2.1.1.10.8 艾滋病病毒灭活试验
（1）目 的
在试验室内测定消毒剂对艾滋病病毒（human immunodeficiencyvirus，HIV）灭活所需的剂量，作为制定对该病毒污染物消毒实用剂量的依据。
（2）实验原理
用细胞感染法测定消毒剂作用前后（或实验组与对照组）样本中HIV 的量。以细胞病变作为判断指标，确定各组病毒的感染滴度，计算消毒剂对 HIV 的灭活对数值。
（3）安全防护
试验中要求采取严密防护措施。 我国规定所有接触 HIV 的试验均需在生物安全三级（biological safety level 3，BSL 3）实验室内进行，并制定有相应的安全防护措施。 在 HIV 灭活试验时，必须严格按照有关安全规定进行。
（4）试验分组
1）试验组。根据所测消毒剂对其他微生物的杀灭或灭活剂量估计，设立适宜的浓度与作用时间组（不少于1个浓度，3个作用时间），对作用时间的设计应不短于30s。 所设组应能测出使 HIV 全部灭活所需的最低有效剂量（药物浓度与作用时间）。
2）阳性对照组。用去离子水代替消毒剂，按试验组规定步骤加入 HIV 悬液进行试验和培养，观察 HIV 生长是否良好。
3）阴性对照组。 用不含 HIV 的完全培养基作为阴性对照，观察所用培养基有无污染，细胞是否生长良好。
4）消毒剂对细胞毒性组。 取 100μl 待测消毒剂，加入含有100μl 用完全培养基制备的 MT4 细胞悬液（含细胞400 000 个/ml）的 96 孔培养板内。 置二氧化碳温箱（37℃）中培养 7 d，观察细胞生长情况，确定消毒剂对细胞无毒性的最高稀释度。
（5）HIV 悬液定量灭活试验操作程序
1）从液氮中取出冻存的 MT4 细胞，在 37℃ 温水中迅速融化，并用细胞维持液洗涤两次后， 转种于加有 10ml 完全培养基培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞对数生长期时收获细胞用于消毒试验。
2）从液氮中取出冻存 HIV-1 毒种，接种于含 10ml 细胞悬液（含细胞 700 000个/ml～800 000 个/ml）培养瓶中。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。收获时，将培养液取出，尽快离心，并将含病毒的上清液按每管 0.5ml 分装于无菌离心管（1.5ml）中，冷冻保存于 -80℃ 备用。如不能立即离心，可暂将培养瓶冷冻保存于-20℃，并争取尽快离心分装。
3）取待测消毒剂，用无菌去离子水作 1:2、1:4、1:8 ...系列稀释。视消毒剂的类型和实验目的，确定最高稀释度。为防止污染培养液，必要时在试验前需将消毒剂过滤除菌。
4）取 50μl 待检消毒剂，与 50μl 病毒原液混合。在规定温度作用一定时间（根据试验要求确定作用时间和温度），立即加入0.9ml 用完全培养基制备的 MT4 细胞悬液（400 000 个/ml），在37℃，放置 40min，以确保残留病毒全部吸附在细胞上。阳性（病毒）对照组试验中，用无菌去离子水代替消毒剂；消毒剂对细胞毒性组试验中，用无菌去离子水代替病毒。
5）取出反应管，立即采取去除残留消毒剂处理。处理可用物理去除法或中和剂法（所用方法需先经试验证明，既可有效去除残留消毒剂，又对细胞和 HIV 无杀灭或抑制作用。
6）在 96 孔培养板上滴定样本中残留的病毒量。先在培养板（96孔）的各孔中，加入 100μl 用完全培养基制备的 MT4 细胞悬液（含细胞 400 000 个/ml）。 同时，用完全培养基对待滴定样本做 1：10 系列稀释，然后取 100μl 稀释好的样本加入已含 MT4 细胞悬液的 96孔培养板内。每个稀释度做 4 孔。
7）将按上述程序加液的 96 孔培养板，放入二氧化碳培养箱中（37℃，5% CO2），逐日在显微镜下观察细胞病变。被感染细胞融合肿胀，出现多核巨细胞。第 4 d，在各反应孔内补加 50μl 新鲜完全培养基。第7d，逐孔观察并记录细胞病变情况。
8）试验重复 3 次。
（6）评价规定
1）对测试滴度的HIV，3次灭活试验后均应不再检出，此时的灭活对数值应≥4.00，可判为该消毒剂浓度与作用时间，对HIV污染物消毒的实验室试验合格。
2）在正常情况下，HIV阳性对照组病毒感染滴度（TCID50）对数值应在5～7之间。阴性对照组宿主细胞生长良好，并且无HIV 检出。所用浓度的消毒液对宿主细胞生长无不良影响。否则，根据发现的问题，或调整 HIV悬液浓度，或选择适宜消毒液浓度，或更换污染试剂和培养基，或改进其他有关条件后，重做试验。
（7）注意事项
1）操作人员应具有较丰富的病毒学实验工作经验，必须绝对遵守BSL3实验室的安全制度。身体状态欠佳，或有伤口时，应暂时停止工作。
2）有感染可能性的操作，均应在BSL3实验室的层流负压超净工作台中进行。
3）一旦发生事故，有病毒感染或污染环境的可能时，切莫惊慌，除立即进行妥善消毒处理外，并应尽快报告实验室和单位领导。
4）本试验周期较长，在全部过程中应注意防止样本污染。
5）因试验难度较大，试验前应尽量考虑周密，特别对各组剂量和组距的合理安排等方面，以能最终做出正确的结论。
2.1.1.11 能量试验
2.1.1.11.1目的
测定连续加入细菌悬液对消毒剂杀菌作用的影响, 以作为确定该消毒剂用于多次消毒污秽物品(含较多有机物),如浸洗拖布的消毒液、浸泡污染医疗器械的消毒液、浸泡洗手消毒液等实用浓度的参考。
2.1.1.11.2 试验器材
(1) 试验菌株 金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 大肠杆菌 8099 绿脓杆菌 ATCC 15442
(2)磷酸盐缓冲液 (PBS,0.03mol/L,pH值7.2～7.4)。
(3)标准硬水(硬度为 342mg/L)：见附录A。
(4)含中和剂营养肉汤培养基 (所用中和剂应为经试验鉴定合格者, 见 2.1.1.5)。
(5)细菌定量杀灭试验所用器材 (见 2.1.1.7.2)。
2.1.1.11.3试验程序
(1)试验用菌悬液配制 选择上述试验菌中对所试消毒剂抗力强者作为试验菌, 配制菌悬液。用标准硬水将酵母粉配成50mg/L 溶液 (pH值6.9～7.1)。然后,吸取试验菌新鲜营养肉汤24h 培养物6.0ml, 加于含 4.0ml酵母液试管中, 混匀。依此配制成的菌悬液, 所含菌量应为 106 cfu/ml～107cfu/ml。
(2)将待测消毒剂用硬水稀释成A(1.5x)、B(x)、C(0.5x) 等3 个浓度的消毒液 (括弧中的 “x” 代表杀菌试验所得有效浓度), 各取 3.0ml 分装于无菌试管内。
(3)第 1 次,取试验菌悬液 1.0ml 加入到第 1 管 A 浓度消毒剂溶液内, 立即混匀。
(4)在 A 管加菌悬液后8min,分别吸取A管内混合液20μl移种至A组的第1批5支盛有 5.0ml 含中和剂营养肉汤培养基管中。
(5)在第1 次加菌悬液后10min，第2次取1.0ml菌悬液加入到A浓度消毒剂管内,立即混匀。
(6)在第2次加入菌悬液后8min(即第1次加菌悬液后18min) 时, 分别吸取 A 管内混合液20μl移种至 A 组的第2批5支盛有5ml 含中和剂营养肉汤培养基管中。
(7)在第2次加入菌悬液后10min(即第1次加菌后20min),取1.0ml 菌悬液加入到 A 浓度消毒剂管内，振摇混匀。
(8)在第3次加入菌悬液后8min(即第1次加入菌液后28min) 时, 分别吸取 A 管内混合液20μl移种至 A 组的第 3 批 5支盛有5ml 含中和剂的营养肉汤培养基管中。
(9)B(x)、C(0.5x)两浓度药液的试验内容和操作程序,与上述A浓度者相同。3 个稀释度消毒药液同一批进行操作时, 可按表2-3 规定的时间和顺序进行。
表 2-3 能量试验操作时间
加菌与移种次序 各浓度组操作时间(第 X min)
A B C
第 1 次加菌 0 1 5
第 1 次移种(5 管) 8 9 13
第 2 次加菌 10 11 15
第 2 次移种(5 管) 18 19 23
第 3 次加菌 20 21 25
第 3 次移种(5 管) 28 29 33
(10)以2支含5ml中和产物 (用同次试验所用消毒剂与中和剂配制) 的营养肉汤培养基管, 加入5μl试验菌液, 作为阳性对照。
(11)以2支含 5ml与上相同的中和产物的营养肉汤培养基管, 作为阴性对照。
(12)将以上各试验组和对照组样本管,置 37℃ 培养箱中培养 48h, 观察是否有菌生长
(13) 所有试验均在20℃±2℃ 水浴中进行。
(14)重复上述试验, 每日 1 次, 以连续取得 3次同一评价结论者为准。
(15)试验中应将试验用菌悬液进行活菌培养计数,其长菌量应在106cfu/ml～107cfu/ml。阳性对照管应变浑浊, 阴性对照, 不应有菌生长。
对照组结果不符合要求时, 应检查原因, 改正后重新进行试验。
2.1.1.11.4 评价规定
当阳性对照管有细菌生长(混浊),阴性对照管无菌生长(透明)时,第 1 次和第 2 次移种的 5管样本中,有 2 管或 2管以上不长菌的浓度组, 作为合格浓度组。如 3 个浓度组均合格, 应降低消毒药液浓度继续试验; 反之,3 个浓度组均不合格, 则增加消毒剂浓度,直至找到最低合格浓度。连续3次重复试验, 得到同样最低合格浓度, 该最低合格浓度可作为设定反复浸泡用消毒液实用浓度的依据。
2.1.1.11.5 结果举例
设对某消毒剂能量试验结果如表 2-4。
表 2-4 某消毒剂能量试验结果
试验序号 消毒剂浓度 3 次加菌后移种 5 管肉汤中细菌生长情况
(%,v/v) (1) (2) (3)
1 0.6 - - - - - + + + + + + + + + +
1.2 - - - - - - + + + - + + + + +
1.8 - - - - - - - - - - - - - - -
2 0.6 + - + + + + + - - + + + + + +
1.2 - - - - - - - - + + + + + + +
1.8 - - - - - - - - - - - - - - +
3 0.6 - - + + + + + - + + + + + + +
1.2 - - - - - + - - - - + + + + +
1.8 - - - - - - - - - - - - - - -
注: "+" 表示有菌生长, "-"表示无菌生长。
结论: 此次试验结果, 该消毒剂的最低合格浓度为 1.2%。
2.1.1.11.6 注意事项
(1)试验应选用规定菌株。
(2) 3 个消毒剂浓度组操作, 应严格按表 2-3规定的时间进行。
2.1.1.12 各种因素对消毒剂杀菌作用影响的测定
2.1.1.12.1 目 的
了解有机物、温度和 pH 对消毒剂杀菌作用的影响规律，为制定消毒剂的实用剂量提供参考。
2.1.1.12.2 试验器材
（1）菌片与菌悬液（按 2.1.1.2 要求和方法制备）。
（2）恒温水浴箱。
（3）冷水浴装置（可放入试管架的容器，以冰水调节水温）
（4）温度计。
（5）pH 计。
（6）有机物,根据消毒剂的使用对象选择，如酵母粉、血清、蛋白胨。
（7）中和剂（经中和剂试验鉴定合格）。
（8）盐酸（用无菌蒸馏水配制）。
（9）氢氧化钠（用无菌蒸馏水配制）。
2.1.1.12.3 试验微生物的选择
根据所测消毒剂鉴定需要决定。一般情况下，除需用于特定微生物者外，对细菌繁殖体应选择大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，作为革兰阳性与阴性细菌的代表即可；用作灭菌剂，可使用枯草杆菌黑色变种芽孢。
2.1.1.12.4 消毒液浓度和作用时间的设定
各种因素影响的测定，均用杀灭相应微生物试验所得最低有效浓度，和 3个～4 个作用时间进行杀灭试验。在 3个～4 个作用时间中，以该最低有效浓度所需的最短有效时间为第 1 时间（T），其后的第 2 时间为第 1 时间的一倍（2T）。 依此，第 3 时间为 3T，第 4 时间为 4T。试验结果应根据需要测出杀灭对数值达 5.00（消毒用）的最低有效剂量。必要时，可根据需要调整消毒剂浓度或作用时间，若第 1 时间较长（> 30min），可根据情况适当缩短作用时间的组距。对第1 时间较短者（＜5min），可根据情况适当延长作用时间的组距。
2.1.1.12.5 有机物对杀灭微生物效果影响的测定
（1）如以小牛血清为有机物代表，应设置无小牛血清对照组；含25% 小牛血清组；含 50% 小牛血清组等 3 组。各组所用消毒液浓度和作用时间，见 2.1.1.12.4。
（2）以稀释液配制的微生物悬液与无菌小牛血清，按 1：1 与3：1 比例混合，分别配成含50%与25%小牛血清的微生物悬液。此含小牛血清的微生物悬液，可用于悬液定量杀菌试验，亦可滴染菌片进行载体定量试验。
（3）试验中根据需要，选择悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验之一进行测定即可。具体试验程序根据微生物种类可参见2.1.1.7。
（4）其它有机物按此设计类推。各组试验应重复 3 次，按相应微生物杀灭试验计算杀灭对数值。
2.1.1.12.6 温度对杀灭微生物效果影响的测定
（1）设置10℃±1℃、20℃±1℃、30℃±1℃等，以10℃为间隔。各组所用消毒液浓度和作用时间，见 2.1.1.12.4。
（2）对要求试验温度高于室温者，用恒温水浴箱（电热）调节；低于室温者用冷水浴装置（加适量冰水）调节。当上述温度调节装置到达要求温度后，放入装有试验样液的试管，同时放入一含与试验样液等量蒸馏水并插有温度计的试管。待试管内温度计指示到达试验所需温度时，开始随后的试验。
（3）根据需要，选择悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验之一进行测定即可。具体试验程序根据微生物种类可分别参见 2.1.1.7。
（4）试验重复 3 次，按相应微生物杀灭试验计算杀灭对数值。
2.1.1.12.7 pH 对杀灭微生物效果影响的测定
（1）本项试验根据所测消毒剂使用溶液的 pH 值，分为以下 3 组进行：
第 1 组 pH 值 x - 2
第 2 组 pH 值 x
第 3 组 pH 值 x + 2
[例如，所测消毒剂使用溶液的 pH 值为 7.8，则 3 组的 pH 值应为：第 1 组 5.8，第 2 组 7.8，第 3 组 9.8。]
各 pH 组所用消毒液浓度和作用时间，见 2.1.1.12.4。
（2）对消毒液 pH 的调节，先用 pH 计测定原消毒剂的pH，在偏酸时慢慢滴加氢氧化钠溶液，偏碱时慢慢滴加盐酸溶液以调整。随时用pH 计测定消毒液的pH。当达到所要求的pH 后，停止调整，进行随后的试验。必要时，在pH 调整后可测定有效成分含量以观察是否受到pH 变化的影响。
（3）根据需要，选择悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验之一进行测定即可。具体试验程序见 2.1.1.7。
（4）试验重复 3 次，按相应微生物杀灭试验计算杀灭对数值。
2.1.1.12.8 评价规定
评价时，有机物影响试验应以不含外加有机物组（直接用稀释液配制微生物）的结果为对照；温度影响试验应以20℃±1℃ 组的结果为对照；pH 影响试验应以消毒剂使用溶液pH组的结果为对照。
（1）该组第 1个～4 个作用时间的试验，对所试微生物杀灭效果均合格，判为该组所试因素无影响。
（2）该组第 2个～4 个作用时间的试验，对所试微生物杀灭效果合格，判为该组所试因素有轻度影响。
（3）该组第 3个～4 个作用时间的试验，对所试微生物杀灭效果合格，判为该组所试因素有中度影响。
（4）该组只第 4 个作用时间的试验， 对所试微生物杀灭效果合格，判为该组所试因素有重度影响。
（5）全部试验对所试微生物杀灭效果均不合格，判为本试验所试因素有严重影响。为取得消毒或灭菌的有效剂量，需增加消毒液浓度或作用时间，重新进行试验。
2.1.1.12.9 注意事项
（1）本试验目的是为制定消毒剂实用剂量提供必要的参考数据，系统研究各种因素对消毒剂杀灭微生物效果的影响，尚需作更多系统的观察。
（2）为加强各组结果的可比性和可重复性，非观察因素应保持稳定不变。例如，在观察有机物的影响时，除有机物浓度根据需要改变外，其他如温度和pH等因素均应先后一致。
2.1.2 消毒剂对物体表面模拟现场和现场消毒鉴定试验
2.1.2.1 消毒剂对食(饮)具消毒效果的模拟现场鉴定试验
2.1.2.1.1 目的
用于鉴定消毒剂对食(饮)具上细菌和病毒的杀灭作用, 并测出所需使用的剂量, 作为确定该消毒剂对食(饮)具消毒实用剂量的参考。
2.1.2.1.2 试验器材
(1)大肠杆菌(8099)。对尚需用于杀灭其他特定细菌者,可增用该特定细菌进行试验。菌悬液制备按2.1.1.2规定的方法和要求进行。
(2))磷酸盐缓冲液(PBS,0.03mol/L,pH7.2)
(3)采样液(在PBS中加入相应的中和剂)
(4)稀释液：见附录A。
(5)中和剂(按2.1.1.5方法鉴定合格者)
(6)胰蛋白胨大豆琼脂培养基
(7)无菌棉拭
(8)规格板(用可略弯曲的软性材料制备,中央留一大小为5.0cm×5.0cm空格作为采样部位)。
(9)试验用食(饮)具样本 瓷碗（盘）和竹或木筷前端12.5cm(周长约2.0cm, 长度为12.5cm，总面积约25cm2)各35个。
2.1.2.1.3 操作程序
(1)按产品使用说明书的用法,选定本试验拟用浓度和作用时间,分别进行大肠杆菌杀灭试验。
(2)用无菌规格板在试验用瓷碗（盘）中间标出染菌区(5.0cm×5.0cm)。用无菌吸管吸取菌悬液,分别滴加于染菌区,每区0.1ml,用无菌L棒在区内涂匀,并置37℃恒温箱干燥。
对筷子取前端12.5cm长度，蘸染预定量菌液后,并置37℃或室温干燥。
(3)将30个染菌碗和3 0个筷子样本，缓缓放入含消毒剂溶液的容器中,使其完全浸没。待作用至规定时间后，将碗轻轻取出, 弃掉消毒剂，分别向磁盘内的染菌区加入5ml采样液，用L棒刮洗染菌区，作用10min，分别取1.0ml样液倾注接种2块平皿。将筷子轻轻取出,放入含15ml采样液的试管中,电动混匀器震荡20s或振敲8 0次，作用10min, 分别取1.0ml样液倾注接种2块平皿。将接种好的平皿放37℃恒温箱培养48h,计数菌落数，作为试验组。
(4)试验中,应设阳性对照组与阴性对照组。阳性对照组的食具与试验组同法染菌,置同样条件下,将5个染菌碗和5只筷子样本浸泡于含有PBS的容器中。待试验组消毒处理完毕后,与试验组同时进行采样和检测。所得细菌定量检测结果作为消毒前菌量。阳性对照组所测得的菌量应在1.25×105 cfu/样本～1.25×106cfu/样本(相当于5×105cfu/cm2～5×106cfu/cm2)。
（5）待试验组与阳性对照组试验结束后,将未用过的同批次中和剂、PBS接种培养基,和未种菌的培养基等,与上述两组样本同时进行培养,作为阴性对照。若有菌生长,更换培养基、PBS或中和剂,重新进行试验。
(6)按下式计算每件食具上的生长菌落数。
每件食具样本生长菌落数（cfu/样本）=平板上平均菌落数×检测时样本稀释倍数
（7）计算杀灭对数值。
2.1.2.1.4 评价规定
以每种食（饮）具30个样本中大肠杆菌杀灭对数值均≥3.00，所用消毒剂的浓度和作用时间为消毒合格剂量。
2.1.2.1.5 注意事项
(1)试验操作过程必须采取严格的无菌技术。直接或间接接触样本的器材必须经灭菌后 使用。模拟现场试验所用食(饮)具在染菌前亦必须经灭菌处理。
(2)每次试验必须设置阳性和阴性对照，绝不可省略。
(3)消毒前后的重复采样(试验组与阳性对照组),不得在食(饮)具同一采样区内进行。
(4)棉拭涂抹采样较难标准化,为此应注意使棉拭的大小,用力的均匀,吸取采样液的量, 洗菌时敲打的轻重等应先后一致。
2.1.2.2 消毒剂对医疗器械的消毒模拟现场鉴定试
2.1.2.2.1 目的
用于鉴定消毒剂对医疗器械上细菌芽孢的杀灭作用作用，并测出消毒所需使用剂量，作为确定对医疗器械处理时实用剂量的参考。
2.1.2.2.2 试验器材
(1)枯草杆菌黑色变种(ATCC 9372)芽孢(下简称芽孢,其悬液的制备按2.1.1.2.3(2)规定进行)
(2)磷酸盐缓冲液(PBS,0.03mol/L,pH7.2)
(3)中和剂溶液(经按2.1.1.2.5规定方法鉴定合格者)
(4)含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基
（5）模拟现场试验用样本(将医用止血钳截断,取其由轴至齿端部分,参照2.1.1.2.4(2)规定方法进行脱脂处理。经压力蒸汽灭菌后,烤干备用)。
(6)塑料试管(1.8cm×18cm)。
2.1.2.2.3 操作程序
(1)以载体浸泡定量杀菌试验进行消毒效果的测定。按产品使用说明书的剂量,选定本试验拟用浓度和和作用时间。
(2)染菌时,用无菌镊子将35个止血钳样本两齿分开，使其一侧齿面朝上,并固定在无菌支撑物上。用0.1ml无菌吸管或100μl无菌移液器,将0.02ml芽孢悬液滴染于样本朝上的齿部,用无菌L型铂金丝涂匀,置37℃恒温箱内干燥备用。
(3)取无菌平皿,按每个载体10ml用量加入消毒液，置20℃±2℃水浴中保温5min。
(4)将30个染菌样本浸没于消毒液中进行消毒处理。
(5)作用至规定时间，取出样本,分别移入含10ml中和剂溶液的塑料试管内。在手掌上振敲80次，分别取样液1.0ml倾注接种两个无菌平皿,放37℃恒温箱培养72h,计数菌落数，作为试验组。
(6)以无菌蒸馏水代替消毒液，将5个染菌样同样条件处理，然后与试验组样本同法进行活菌培养计数，作为阳性对照组，其菌量应在5×105 cfu/样本～5×106cfu/样本。
(7)试验结束后,将用过的同批次中和剂、采样液、稀释液接种培养基,进行培养;另将未用过的同批培养基亦放入恒温箱内培养,作为阴性对照。
2.1.2.2.4 评价规定
在规定作用时间内，阳性对照组均有菌生长，活菌培养计数达到规定的数量，阴性对照均无菌生长时，以对试验组30个样本上人工污染芽孢的杀灭率对数均值≥3.00，可判为消毒合格。
2.1.2.2.5 注意事项
于本试验有关的其它试验中的注意事项亦适用于本试验。
2.1.2.3消毒剂对医疗器械的模拟现场灭菌试验
2.1.2.3.1目的
用于验证消毒剂对人工染有芽孢的医疗器械灭菌效果。
2.1.2.3.2 试验器材
(1)枯草杆菌黑色变种(ATCC 9372)芽孢(下简称芽孢,其悬液的制备按2.1.1.2.3(2)规定进行)
(2)磷酸盐缓冲液(PBS,0.03mol/L,pH7.2)
(3)中和剂溶液(经按2.1.1.5规定方法鉴定合格者)
(4)含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基
（5）模拟现场试验用样本(将医用止血钳截断,取其由轴至齿端部分,参照2.1.1.2.4(2)规定方法进行脱脂处理。经压力蒸汽灭菌后,烤干备用)。
(6)塑料试管(1.8cm×18cm)。
2.1.2.3.3 操作程序
(1)按产品使用说明书的剂量,选定本试验拟用浓度和作用时间。25个染菌样本制备和灭菌处理等,按2.1.1.2.3中 (1)～(3)规定进行。
(2) 取无菌平皿，按每个载体10ml用量加入消毒液，置20℃±2℃水浴中保温5min。
(3)将20个染菌样本浸没于消毒液中进行灭菌处理，作用至规定时间，将样本取出，分别放于含10ml中和剂肉汤的试管内（共20支），置37℃培养箱中定性培养7d，观察最终结果，作为试验组。有菌生长者，肉汤培养基呈轻度浑浊，有皱褶状菌菌墨，轻轻振摇可见絮状沉淀，无菌生长者肉汤清澈透明。
（4）以无菌蒸馏水代替消毒液，将两个染菌载体依上同样条件处理，然后与试验组载体同法接种、培养、观察结果，作为阳性对照组。
(5)另取3个染菌样本，分别放入10ml中和剂溶液塑料试管内。振荡20s，或在手掌上振敲80下，取样液进行活菌培养计数。培养72h计数菌落。作为菌数对照组，其活菌培养计数结果, 菌量应为5×105cfu/样本～5×106cfu/样本。
(6)试验结束后,将用过的同批次中和剂、采样液、稀释液接种培养基,进行培养;另将未用过的同批培养基亦放入恒温箱内培养,作为阴性对照。
(7)试验重复3次。
2.1.2.3.4 评价规定
各次试验组所有60个样本均无菌生长,同时阳性对照组均有菌生长，菌数对照组活菌培养计数达到规定的数量,而阴性对照组均无菌生长时,可批为灭菌合格。
2.1.2.3.5 注意事项
(1)灭菌效果观察时，应严格无菌操作，否则可将灭菌合格误判为失败。
(2)于本试验有关的其它试验中的注意事项亦适用于本试验。
2.1.2.4 连续使用稳定性试验
2.1.2.4.1目的
用于测定消毒剂在反复取放浸泡医疗器械条件下的使用有效期。
2.1.2.4.2 试验器材
(1)枯草杆菌黑色变种(ATCC 9372)芽孢(下简称芽孢,其悬液的制备按2.1.1.2.3.(2)规定进行)
(2)磷酸盐缓冲液(PBS,0.03mol/L,pH7.2)
(3)中和剂溶液(经按2.1.1.5规定方法鉴定合格者)
(4)含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基：见附录A。
（5）不锈钢载体(直径1.2cm圆片)
(6)满载用医疗器械(选用医用剪刀、止血钳等小型器械，或根据需要选用其他器械。
(7)无菌带盖搪瓷盘。
2.1.2.4.3 操作程序
(1)以枯草杆菌黑色变种芽孢为试验菌。
(2)产品说明书中规定的浓度作为本试验所用浓度,设3个作用时间,进行载体浸泡定量杀菌试验(见2.1.1.7.5)。
(3)试验时,配制双份2000ml消毒液，分别盛装于2个无菌带盖搪瓷盘中。各放入清洁的试验用医疗器械，使达满载要求。每次试验,同时对2个搪瓷盘中的消毒液进行检测。
(4)搪瓷盘内放入器械后,每日将器械取出,用清水洗涤,沥干,再回放入消毒液中。连续 每日将器械取出、洗涤、沥干、再放入，直至试验结束。
(5)放入器械当日,吸取消毒液样本，以载体浸泡定量杀菌试验法(见2.1.1.7.5)测定该消毒液 对芽孢的杀灭效果。而后,根据消毒剂稳定性规定每隔一定日期吸取一次样本进行同样的杀芽孢试验,直至观察到失效时(或规定的日期)为止。全过程中吸取样液检测次数不得少于3次。
2.1.2.4.4 评价规定
试,验重复3次，以3次试验中连续使用有效期最短的日期为其有效期。
在规定作用时间内, 阳性对照组均有菌生长，活菌培养计数达到规定的数量, 阴性对照组均无菌生长时, 对芽孢的杀灭对数值均≥3.00，可判为消毒合格。各次试验所有样本均,无菌生长,可判为灭菌合格。
2.1.2.4.5 注意事项
(1) 盛装消毒液的搪瓷盘，在操作完毕后应加盖，以免有杂菌污染。
(2) 灭菌效果观察时，应严格无菌操作，否则可将灭菌合格误判为失败。
(3)本试验有关的其它试验中的注意事项亦适用于本试验。
2.1.2.5 消毒剂对手消毒模拟现场试验
2.1.2.5.1 目的
用于测定消毒剂对人工污染于手表面细菌的杀灭作用, 并作为确定该消毒剂对手消毒实用剂量的参考。
2.1.2.5.2 试验器材
（1）大肠杆菌8099或NCTC 10536,对尚需用于杀灭其他特定细菌目的者,可增用该特定细菌进行试验。菌悬液制备按2.1.1.2规定的方法和要求进行。
（2）胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）：见附录A。
（3）胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）：见附录A。
（4）中和剂(经鉴定合格)
（5）液体肥皂 200g/L
（6）参考样品 正丙醇 60%（V/V）异丙醇 60%（V/V）
（7）标准硬水：见附录A。
（8）磷酸盐缓冲液(PBS,0.03mol/L,pH7.2)。
（9）无菌纱布巾
（10）吸管、试管、平皿若干
（11）振荡混合器
2.1.2.5.3 试验步骤
(1)菌悬液的制备 取2支在TSB中培养18h～24h的大肠杆菌培养物分别接种于1LTSB大三角烧瓶中，在36℃±1℃培养箱中培养18h～24h,用TSB将其稀释为2×108cfu/ml～2×109cfu/ml菌悬液。
（2）将12名～15名志愿者随机分为两组，第一组使用参考样品，第二组使用试验样品
（3）使用液体肥皂洗手1min 去除手表面污染的自然菌，然后用无菌纱布将手擦干。
（4）将2×108cfu/ml-2×109cfu/ml大肠杆菌的菌悬液放入一无菌容器中，
（5）将手掌中间到指尖部位浸入菌悬液中，手指分开，停留５s，将手离开菌悬液，在空气中干燥３min。
（6）干燥后立即将拇指与其它手指尖在含 10ml TSB的平皿中搓洗１min，取适当稀释度接种平皿。计数菌落数，作为试验前菌数。
（7）不再重复污染手，立即进行消毒处理。
（8）按说明书介绍的用量、作用时间和使用频率以标准的洗手方法（如图2-1）搓擦30s～60s（卫生手消毒）或最长5min（外科手消毒）。
（9）以流动的自来水冲洗5s，抖掉手上残留的水。
(10) 立刻将拇指与其它手指尖在含 10ml含中和剂的TSB的平皿中搓洗1min，做适当稀释后，分别取样液1.0ml以倾注法接种两个无菌平皿,放37℃恒温箱培养48h,计数菌落数，作为试验组。
(11) 参考样品组,对于卫生手消毒，取3 ml异丙醇（propan-2-ol） 60%（ml/100ml）到入手心中，按标准的洗手方法用力搓擦30s。以确保手的所有部位均匀接触异丙醇。重复使用异丙醇按上述方法搓擦使总的搓擦时间为60s。对于外科手消毒,使用3ml正丙醇（propan-1-ol） 60%(ml/100ml) 按标准的洗手方法用力搓擦，当接近干燥时，再加3ml正丙醇搓擦。以保持作用3min。
1.掌心对掌心搓擦 2.手指交错掌心对手背搓擦 3.手指交错掌心对掌心搓擦
4.两手互握互搓指背 5.拇指在长中转动搓擦 6.指尖在掌心中摩擦
图2-1 标准的洗手方法
(12) 用流动的自来水冲洗5s，抖掉手上残留的水。
(13) 其余步骤与试验样品组相同。
(14) 在试验当日，第一组与第二组样品对换，重复上述试验。
(15) 分别计算参考样品组和试验样品组的菌数减少的对数值。
2.1.2.5.4 评价规定
(1) 试验样品的菌数减少的对数值不小于参考样品的菌数减少的对数值为合格。
(2) 如果试验样品的菌数减少的对数值小于参考样品的菌数减少的对数值，应进行统计学处理，以确定差异是否显著。
(3) 如果试验样品的菌数减少的对数值显著小于参考样品的菌数减少的对数值，可判为消毒合格。如果试验样品菌数减少的对数值显著少于参考样品菌数减少的对数值，表明该试验样品不符合本规范的要求。
2.1.2.5.5 注意事项
(1)试验必须在同一受试者、同一天、相同环境、同样条件下进行，使试验样品和参考样品的结果具有可比性。
（2）所有受试者应年满18岁，身体健康。手部皮肤应无破损、无皮肤病，手指甲短而干净。
（3）试验用菌悬液应在第1只手浸入后3h内使用。在1次试验中，无论使用试验样品还是参照样品，所有受试者手的染菌都应使用同一批菌悬液。
2.1.2.6 消毒剂对手消毒现场试验
2.1.2.6.1目的
测定消毒剂对手表面自然菌消毒所需使用的剂量,作为确定该消毒剂对手消毒实用剂量的参考。
2.1.2.6.2试验器材
（1）采样液 含适宜中和剂的0.03mol/L磷酸盐缓冲液 pH7.2（中和剂经鉴定合格)
（2）无菌棉拭
（3）稀释液 0.1%吐温80的0.03mol/L磷酸盐缓冲液 pH7.2
（4）磷酸盐缓冲液(PBS,0.03mol/L,pH7.2)。
（5）标准硬水：见附录A。
（6）无菌纱布巾
（7）胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）：见附录A。
（8）胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）：见附录A。
（9）振荡混合器
（10）吸管、试管、平皿若干。
2.1.2.6.3试验步骤
(1) 在使用现场,随机选定受试者。试验不少于30人次。
(2) 消毒前,在受试者双手相互充分搓擦后, 让受试者左手指并拢,用无菌棉拭在含10ml稀释液试管中浸湿,于管壁上挤干后,在五指屈面指尖至指根,往返涂擦2遍,每涂擦一遍,将棉拭转动一次。采样后,以无菌操作方式将棉拭采样端剪入采样液试管内，作为阳性对照组样本。
(3)根据消毒剂使用说明书的方法对右手进行消毒，对手的卫生消毒一般设定作用时间为1min, 对外科洗手后的泡手一般设定作用时间为3min。消毒后用采样液代替稀释液，与阳性对照组同样的方法对受试者右手上残留的自然菌采样一次,作为试验组样本。
(4)分别将未用过的同批采样液、稀释液各1.0ml、棉拭1份～2份作为阴性对照组样本。
(5)分别取试验组、阳性对照组和阴性对照组样本各0.5ml，以琼脂倾注法接种平皿，每个样本接种2个平皿，放37℃恒温箱中培养48h, 观察最终结果。
(6) 计算杀灭对数值
2.1.2.6.4 评价规定
阳性对照组应有较多细菌生长，，阴性对组应无菌生长，以对30人次手上自然菌的平均杀灭对数值 ≥1 ，可 判 为 消 毒 合 格 。
2.1.2.6.5 注意事项
(1)本试验需有志愿者参与,重复人次较多,一人可多次受试,但不得在一批试验或同日反复参与,否则可影响结果的准确性。
(2) 受试者接受试验时，不得触摸任何表面,以免使手的试验部位沾染杂菌。
(3)棉拭涂抹采样，较难标准化,为此应尽量使棉拭的大小，用力的均匀,吸取采样液的量, 以及洗菌时敲打的轻重等先后保持一致。
(4) 擦拭消毒时，涂药量要适宜，涂抹要均匀。
(5) 现场样本须及时检测,室温存放不得超过2h。否则应放4℃冰箱内,但亦不得超过4h。
2.1.2.7 消 毒 剂 对 皮 肤 消 毒 模 拟 现 场 试 验
2.1.2.7.1 目的
用于测定消毒剂对人工污染于皮肤表面细菌的杀灭作用, 并作为确定该消毒剂对皮肤消毒实用剂量的参考。
2.1.2.7.2试验器材
（1）大肠杆菌8099或NCTC10536对尚需用于杀灭其他特定细菌目的者,可增用该特定细菌进行试验。
（2）胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）：见附录A。
（3）磷酸盐缓冲液(PBS,0.03mol/L,pH7.2)
（4）采样液 含适宜中和剂的0.03mol/L磷酸盐缓冲液 pH7.2（中和剂经鉴定合格）。
（5）液体肥皂 200g/L
（6）金属筒 （直径2.2cm、高度3cm）
（7）尼龙刮菌棒
（8）无菌纱布巾
（9）吸管、试管、平皿若干
（10）振荡混合器
（11）一次性接种环（直径4mm）
（12）外用皮肤消炎药膏(例如：百多帮抗生素软膏)
（13）皮肤消毒剂（例如4%葡糖酸洗必泰）
（14）恒温箱
2.1.2.7.3 试验步骤
（1）菌悬液的制备按2.1.1.2.3规定的方法和要求进行。
（2）使用液体肥皂清洗受试者前臂内侧1min，用自来水冲净残留皂液，然后用无菌纱布将手擦干。以去除前臂内侧表面污染的自然菌。
（3） 在受试者的每只前臂中段（不要在手腕和肘皱褶处），用带有印墨直径为3.0cm的玻璃筒扣在皮肤上，划分出一个试验区。
（4）使用加样器取10μl上述菌悬液，接种于前臂试验区（使回收菌落数为2×106 cfu/试验区～1×107 cfu/试验区），用一次性接种环，把菌悬液涂成一圆形，并与试验区边缘应有4mm～5mm的距离，使其在空气中自然干燥。
(5) 根据消毒剂使用说明书的方法对右前臂内侧进行消毒，一般设定作用时间为1 min～3min。
（6）消毒后用采样液对前臂上接种的区域进行取样。采样时，将金属筒放置于试验区中间部位，罩住染菌区，不要接触到盖有印墨的边缘。将1.0ml采样液吸移至金属筒内，用尼龙刮菌棒刮洗金属筒罩住区域内的皮肤60s,将筒内液体吸移至试管内，再加1.0ml采样液对该区域内的皮肤进行第二次刮洗30s，将第二次擦洗的液体，注入含第一次刮洗液体的试管中，作为试验组样本。
（7）以蒸馏水代替消毒剂对左前臂中段做同样处理，用稀释液做适当稀释，取适宜稀释度作为对照组样本。
（8）分别将未用过的同批采样液、稀释液各1.0ml作为阴性对照组样本。
（10）分别取试验组、对照组和阴性对照组样本各1.0ml，以琼脂倾注法接种平皿，每个样本接种2个平皿，放37℃恒温箱中培养48h, 观察最终结果。
（11）计算杀灭对数值。
（12）试验不得少于15人次。
2.1.2.,7.4．评价规定
对照组回收菌落数为2×106cfu/试验区～1×107cfu/试验区，，阴性对组应无菌生长，且对每一人次皮肤表面人工污染的大肠杆菌的杀灭对数值 均 ≥ 3 ， 可 判 为 消 毒 合 格 。
2.1.2.7.5注意事项
（1）受试者录用标准
1）年龄介于18岁至65岁的男性或女性；
2）受试者应身体健康；
3）前臂皮肤应完好无损且没有皮肤病及其它皮肤问题。
（2）排除受试者的标准,如果受试者有下列情况之一，不能被录用参加试验
1）怀孕妇女；
2）诊断患有糖尿病、肝炎、艾滋病（HIV阳性）、器官移植者。
（3）试验采样结束后，先用70%的酒精对受试者前臂进行消毒，然后用皮肤消毒剂（如：4%葡糖酸洗必泰）对两只前臂进行消毒处理，处理后清水冲洗，擦干，再涂少量的抗生素软膏于试验区，以防皮肤感染。
（4）在试验完成后的48h至72h内，受试者如发现前臂上有小脓疱、水疱，隆起的红色痒疱，应及时通知检验单位。
2.1.2.8 消毒剂对皮肤消毒现场试验
2.1.2.8.1目的
测定消毒剂对皮肤表面自然菌消毒所需使用的剂量,以作为确定该消毒剂对手消毒实用剂量的参考。
2.1.2.8.2试验器材
（1）采样液 含适宜中和剂的0.03mol/L磷酸盐缓冲液 pH7.2（中和剂经鉴定合格)
（2）无菌棉拭
（3）稀释液 0.1%吐温80的0.03mol/L磷酸盐缓冲液pH7.2
（4）磷酸盐缓冲液(PBS,0.03mol/L,pH7.2)。
（5）标准硬水：见附录A。
（6）无菌纱布巾
（7）规格板(用牛皮纸制备,中央留一3.0cm×10.0cm的空格作为采样部位)121℃15min灭菌备用。
（8）胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）
（9）振荡混合器
（10）吸管、试管、平皿若干
2.1.2.8.3试验步骤
(1) 在使用现场,随机选定受试者。试验不少于30人次。
(2) 消毒前,让受试者将左右前臂内侧中段相互充分对搓后, 将规格板放于受试者左前臂内侧中段表面，用无菌棉拭在含10ml稀释液试管中浸湿,于管壁上挤干后,在规格板的框定的区域内,横向往返涂擦3遍,纵向往返涂擦10遍，每涂擦一遍,将棉拭转动一次。采样后,以无菌操作方式将棉拭采样端剪入采样液试管内，用稀释液作适当稀释，取适宜稀释度作为阳性对照组样本。
(3)根据消毒剂使用说明书的方法对右前臂内侧进行消毒，一般设定作用时间为1～3min。消毒后用采样液代替稀释液，与阳性对照组同样的方法对受试者右前臂内侧表面残留的自然菌采样一次,作为试验组样本。
(4)分别将未用过的同批采样液、稀释液各1.0ml、棉拭1份～2份作为阴性对照组样本。
(5)分别取试验组、阳性对照组和阴性对照组样本各1.0ml，以琼脂倾注法接种平皿，每个样本接种2个平皿，放37℃恒温箱中培养48h, 观察最终结果。
(6) 计算杀灭对数值
2.1.2.8.4 评价规定
阳性对照组应有较多细菌生长，，阴性对组应无菌生长，以对30人次批皮肤表面自然菌的平均杀灭对数值 ≥1 ， 可 判 为 消 毒 合 格 。
2.1.2.8.5注意事项
(1)本试验需有志愿者参与,重复人次较多,一人可多次受试,但不得在一批试验或同日反复参与,否则可影响结果的准确性。
(2) 受试者接受试验时，不得触摸任何表面,以免使试验部位沾染杂菌。
(3) 棉拭涂抹采样，较难标准化,为此应尽量使棉拭的大小，用力的均匀,吸取采样液的量, 以及洗菌时敲打的轻重等先后保持一致。
(4) 擦拭消毒时，涂药量要适宜，涂抹要均匀。
(5) 现场样本须及时检测,室温存放不得超过2h。否则应放4℃冰箱内,但亦不得超过4h。
2.1.2.9 消毒剂对其他表面消毒模拟现场鉴定试验
2.1.2.9.1 目的
用于鉴定消毒剂对人工污染于一般物体(指除本规范已有专门规定如食(饮)具、医疗器械等以外的物体)表面细菌的杀灭作用,作为确定消毒剂对上述表面消毒实用剂量的参考。其他方法对一般物体表面消毒效果的鉴定,亦可参照本试验的原则进行。
2.1.2.9.2 试验器材
(1) 大肠杆菌(8099)与金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)。如需用于杀灭其特定微生物者, 可增用该特定微生物进行试验。菌悬液制备,按2.2.2规定的方法和要求进行。
(2) 磷酸盐缓冲液(PBS,0.03mol/L,pH7.2)
(3) 采样液(在PBS中加入相应的中和剂)
(4) 稀释液(含0.1%吐温80的PBS溶液)
(5) 中和剂(按2.2.5方法鉴定合格者)
(6) 胰蛋白胨大豆琼脂培养基
(7) 无菌棉拭
(8) 规格板(用不锈钢材料制备,中央留一 5.0cm×5.0cm的空格作为采样部位)
2.1.2.9.3 试验步骤
(1)以人工染菌实物为消毒对象。在无特殊要求情况下,可用木制桌面为代表,进行消毒效果观察。
(2)每次试验,各类物品表面测试30个样本。
(3)染菌时,选物品较平的部位,于规格板中央空格,用无菌棉拭沾以菌悬液均匀涂抹被试表面的60个区块(各为25cm2)。待自然干燥后进行试验。30个区块作为阳性对照区，30个区块为试验区。
(4)消毒前,将无菌棉拭于含5ml稀释液试管中沾湿,对30个对照组区块涂抹采样，每区块横竖往返各8次。采样后,以无菌操作方式将棉拭采样端剪入原稀释液试管内,振打80次，用稀释液做适当稀释后，作为阳性对照组样本。
(5)根据说明书中介绍的使用剂量将消毒剂喷雾或涂擦于 物体表面进行消毒。消毒后,将无菌棉拭于含5ml采样液试管中沾湿,分别对30个消毒区块进行涂抹采样，每区块横竖往返各8次。采样后,以无菌操作方式将棉拭采样端剪入原采样液试管内，电动混匀器振荡20s或振打80次，作为消毒组样本。
(6) 试验结束后，将用过的同批次中和剂、稀释液各1.0ml接种培养基,作为阴性对照组样本。
(7)将阳性对照组、阴性对照组和消毒组样本,每份吸取1.0ml，以琼脂倾注法接种平皿，每个样本接种2个平皿，放37℃恒温箱中培养48h, 观察最终结果。
(8) 计 算 杀 灭 对 数值。
2.1.2.9.4 评价规定
试验重复3次, 阳性对照组检测菌量应在1.25×107 cfu/样本～1.25×108 cfu/样本(相当于5×105 cfu/cm2～5×106cfu/cm2), 阴性对组无菌生长，所有样本的杀 灭 对 数值均≥3 ，可 判 为 消 毒 合 格 。
2.1.2.9.5 注意事项
(1)试验操作必须采取严格的无菌技术。
(2)每次试验均需设阳性和阴性对照,绝不可省略。
(3)消毒前后采样(阳性对照组和消毒试验组),不得在同一区内进行。
(4)棉拭涂抹采样较难标准化,为此应尽量使棉拭的大小,用力的均匀,吸取采样液的量, 洗菌时敲打的轻重等等先后一致。
(5)现场样本须及时检测。室温存放不得超过2h,否则应置4℃冰箱内,但亦不得超过4h。
2.1.2.10 消毒剂对其他表面消毒现场鉴定试验
2.1.2.10.1 目的
用于鉴定消毒剂对一般物体[指除本规范已有专门规定如食(饮)具、医疗器械等以外的物体]表面自然菌的杀灭作用,以作为确定消毒剂对上述表面消毒实用剂量的参考。
2.1.2.10.2 试验器材
(1) 磷酸盐缓冲液(PBS,0.03mol/L,pH7.2)
(2) 采样液(在PBS中加入相应的中和剂)
(3) 稀释液(含0.1%吐温80的PBS溶液)
(4) 无菌棉拭
(5) 规格板(用不锈钢材料制备,中央留一 5.0cm×5.0cm的空格作为采样部位)
(6) 胰蛋白胨大豆琼脂培养基
2.1.2.10.3 操作程序
在使用现场，按说明书介绍的用量、作用时间 、使用频率和消毒方法消毒物体表面，检测样本数应≥30份。
(1)随机取物体表面(桌面、台面、门等)，用规格板标定2块面积各为25cm2的区块，一供消毒前采样，一供消毒后采样。
(2)消毒前,将无菌棉拭于含5ml稀释液试管中沾湿,对一区块涂抹采样，横竖往返各8 次。采样后,以无菌操作方式将棉拭采样端剪入原稀释液试管内, 震荡20s或振打80次，做适当稀释后，作为阳性对照组样本。
(3)根据规定的剂量,将消毒剂喷雾或涂擦于物体表面进行消毒。消毒后,将无菌棉拭于含5ml采样液试管中沾湿,对消毒区块涂抹采样，横竖往返各8次。采样后,以无菌操作方式将棉拭采样端剪入原采样液试管内，电动混匀器震荡20s或振打80次，作为消毒组样本。
(4)试验结束后，将用过的同批次中和剂、稀释液各1.0ml接种培养基,作为阴性对照组样本。
(5)将阳性对照组、阴性对照组和消毒组样本,每份吸取1.0ml,以琼脂倾注法接种平皿，每个样本接种2个平皿，放37℃恒温箱中培养48h, 观察最终结果。
(6) 计 算 杀 灭 对 数.值。
2.1.2.10.4评价规定
试验重复3次, 阳性对照组应有较多细菌生长，，阴性对组应无菌生长，消毒样本的平均杀 灭 对 数 值 ≥1 ， 可 判 为 消 毒 合格 。
2.1.2.10.5 注意事项：
(1)在现场试验中,自然菌的种类较复杂,平板上常出现大面积霉菌生长,导致无法计数菌落。此时,在两个平行的平板中如有一个平板可数清菌落数,即按该平板菌落数计算结果。如两平板均有大面积霉菌生长,应重新进行试验。
(2)试验操作必须采取严格的无菌技术。
(3)每次试验均需设阳性和阴性对照,绝不可省略。
(4)消毒前后采样(阳性对照组和消毒试验组),不得在同一区块内进行。
(5)棉拭涂抹采样较难标准化,为此应尽量使棉拭的大小,用力的均匀,吸取采样液的量, 洗菌时敲打的轻重等等先后一致。
(6)现场样本须及时检测。室温存放不得超过2h,否则应置4℃冰箱内,但亦不得超过4h。
2.1.3 空气消毒效果鉴定试验
2.1.3.1 目的
检测消毒器械或消毒剂对空气中细菌的杀灭和(或)清除作用,以评价其对空气的消毒效果,并测出所需使用剂量。其他方法对空气的消毒效果,亦可参照本试验的有关原则进行。
2.1.3.2 试验设备和器材
(1) 试验菌为白色葡萄球菌 8032，其菌悬液的制备方法见 2.1.1.2。
(2) 采样液 [ 用于液体撞击式采样器采样。非化学因子杀菌试验时，用含抗泡沫剂( 辛醇或橄榄油 )的营养肉汤培养基；消毒剂杀菌试验时，用含相应中和剂的营养肉汤培养基。]。
(3) 中和剂( 按 2.1.1.2.5 方法鉴定合格者)。
(4) 磷酸盐缓冲液( PBS,0.03 mol/L,pH 7.2 )。
(5) 普通营养肉汤培养基。
(6) 普通营养琼脂培养基。消毒剂杀菌试验时,尚需在其中加入相应的中和剂。
(7) 相邻的一对气雾柜或气雾室,一个用于消毒试验,一个用于试验对照。一对气雾柜或气雾室所处环境(包括温度、湿度、光照、密闭性、和通风条件等)应一致。柜(或室)宜以铝合金和玻璃构建。应安装温度和湿度调节装置以及通风机过滤除菌或其它消毒装置和相应管道, 此外,还应开启喷雾染菌、给消毒剂、采样、袖套操作和样本传递等窗口。
(8) 喷雾染菌装置,包括:空气压缩机、压力表、气体流量计、气溶胶喷雾器等。喷出细菌气溶胶微粒的直径 90% 以上应在 1μm～10μm 之间。
(9) 空气微生物采样装置,包括:六级筛孔空气撞击式采样器、液体撞击式采样器、抽气设备、气体流量计等。
(10) 环境监测器材,如温度计、湿度计等。
2.1.3.3 试验阶段
在进行正式空气消毒前,应先进行预备试验,了解所测消毒剂或消毒器械是否对试验菌具有杀灭作用( 悬液定量杀菌试验法,见 2.1.1.7.4 )，以便设定正式试验的剂量分组。
当预备试验证明拟测试的消毒剂或消毒器械有可能用于空气消毒时,即可依次进行随后的正式试验。由于空气消毒试验操作难度大,且其消毒空间愈大,难度愈大,故最好由小到大逐步进行,以免造成试验的反复,耗费人力、物力和时间。空气消毒试验分为实验室试验、模拟现场试验与现场试验。三个阶段试验的特点见表 2-5。
表 2-5 各阶段空气消毒试验的特点
项 目 实验室试验 模拟现场试验 现场试验
目 的 测定最低有效剂量 测定最低有效剂量 验证实用消毒效果
试验柜(室) ≥1m3柜 10m3～20m3柜 ≥20m3房间
采样器 液体撞击式 六级筛孔空气撞击式 六级筛孔空气撞击式
菌 株 白色葡萄球菌 白色葡萄球菌 空气中自然菌
试验菌雾粒 <10μm <10μm 不 定
温 度 20℃～25℃ 20℃～25℃ 自然条件
相对湿度 50%～70% 50%～70% 自然条件
中和剂 加于采样液中 加于采样培养基中 加于采样培养基中
对 照 需有自然消亡对照 需有自然消亡对照 不需自然消亡对照
(衰亡率<50%) (衰亡率<50%)
结果计算 杀灭率 杀灭率 消亡率
2.1.3.4 实验室试验与模拟现场试验操作程序
(1) 取试验菌菌悬液，用无菌脱脂棉过滤后，再用营养肉汤培养基稀释成所需浓度。
(2) 同时调节两个气雾柜(或室)的温度、相对湿度至试验要求的温度和相对湿度。
(3) 将使用的器材一次放入气雾柜(或室)内,将门关闭。此后,一切操作和仪器设备的操纵均在柜(或室)外通过带有密封袖套的窗口或摇控器进行。直至试验结束，始可将门打开。
(4) 按预备试验确定的压力、气体流量及喷雾时间喷雾染菌。边喷雾染菌，边用风扇搅拌。喷雾染菌完毕,继续搅拌 5 min,而后静置 5 min，同时对对照组和试验组气雾柜(或室)分别进行消毒前采样，作为对照组试验开始前和试验组消毒处理前的阳性对照(即污染菌量)。气雾柜(或室)内空气细菌浓度应达 5′104 cfu/m3～5′106 cfu/m3 (按消毒处理前阳性对照样本检测结果计)。
(5) 在模拟现场试验时,用六级筛孔空气撞击式采样器采样,采样时，将六级筛孔空气撞击式采样器放在柜室中央 1 m 高处(采样方法按采样器使用说明书进行)。在实验室试验时,气雾柜内用采样量较小的液体撞击式采样器采样,采样器置柜内中央处。
(6) 按产品说明书规定方法和根据预备试验结果所设计的用量,在试验气雾柜(或室)内进行消毒。对照组气雾柜室同时作相应(不含消毒剂)处理。
(7) 作用至规定时间，对试验组和对照气雾柜(或室)按前述要求同时进行采样。待作用至第二个预定消毒时间，再次进行采样。如此按作用时间继续分段采样,直至规定的最终作用时间为止。
(8) 在实验室试验阶段,用液体撞击式采样器采集的样本,按 2.1.1.3 所示方法进行活菌培养计数,在 37℃ 培养箱内培养 48h,观察最后结果。
(9) 在模拟现场试验阶段,用六级筛孔空气撞击式采样器采样时, 采样平板直接放入 37℃ 培养箱中培养 48 h,观察最后结果,计数生长菌落。
(10) 全程试验完毕，对表面和空气中残留的细菌做最终消毒后,打开通风机过滤除菌排风,排除柜(或室)内滞留的污染空气,为下一次试验作好准备。
(11) 在完成试验组与阳性对照组采样和样本接种后,应将未用的同批培养基、采样液和 PBS 等(各取 1份～2 份),与上述两组样本同时进行培养或接种后培养,作为阴性对照。若阴性对照组有菌生长,说明所用培养基或试剂有污染,试验无效,更换无菌器材重新进行。
(12)同一条件试验重复 3 次,每次均分别计算其杀灭率。3 次结果的杀灭率均 ≥99.90% 时,可判为消毒合格。杀灭率的计算方法如下:
[ Nt:空气中细菌的自然消亡率;
V0 与 Vt:分别为对照组试验开始前和试验过程中不同时间的空气含菌量;
Kt:消毒处理对空气中细菌的杀灭率;
V0'与 Vt':分别为试验组消毒处理前、和消毒过程中不同时间的空气含菌量。]
消毒前后空气中的含菌量按下列公式计算：
[ 举例:用某消毒剂对气雾柜内空气消毒 10 min,试验组消毒前空气含菌量为 100 000 cfu/m3,消毒后为 100 cfu/m3; 对照组处理前空气含菌量为 90 000 cfu/m3,处理后为 50 000 cfu/m3。该消毒剂作用 10 min 对空气中微生物的杀灭率按下法计算:
① 细菌在空气中 10 min 的自然消亡率为:
② 对空气中微生物的杀灭率为:
该次试验,消毒剂作用 10min,可将空气中细菌杀灭 99.82%。]
2.1.3.5 现场试验
(1) 根据使用时的实际情况, 选择有代表性的房间并在室内无人情况下进行消毒效果观察。观察时, 在消毒处理前用六级筛孔空气撞击式采样器进行空气中自然菌采样, 作为消毒前样本 (阳性对照)。消毒处理后,再作一次采样,作为消毒后的试验样本。
(2) 采样时,采样器置室内中央1.0m 高处。房间大10m2 者,每增加10m2 增设一点。
(3) 因现场试验环境条件变化较多,难以统一,无法测定准确的自然沉降率,故只按所得消亡率(自然衰亡和消毒处理中杀菌的综合效果)做出验证结论。消亡率的计算按下式进行:
[举例:一无人手术室,消毒前采样,空气中的平均含菌量为 5000 cfu/m3。用某消毒剂喷雾对室内空气消毒 30 min 后采样,含菌量减至 50 cfu/m3。该消毒剂处理 30 min 后,室内空气中自然菌的消亡率可按下法计算:
该消毒剂作用 30 min,可使房间内空气中自然菌的消亡率达 99.00%。]
(4) 试验采样完成后, 应将未用的同批培养基, 与上述试验样本同时进行培养或接种后培养, 作为阴性对照。阴性对照组若有菌生长,说明所用培养基有污染, 试验无效,更换后重新进行。
(5) 试验重复 3 次或以上。计算出每次的消亡率。除有特殊要求者外,对无人室内进行的空气消毒,每次的自然菌消亡率均 ≥90% 者为合格。
2.1.3.6 注意事项
(1) 试验中,因控制统一的条件较难,故每次均需同时设置试验组与对照组。两组条件尽量保持一致。消毒前、后及不同次数间的环境条件亦应尽量保持一致。
(2) 注意记录试验过程中的温度和相对湿度, 以便分析对比。
(3) 所采样本应尽快进行微生物检验，以免影响结果的准确性。
(4) 每次试验完毕，气雾柜、气雾室应充分通风。必要时消毒冲洗间隔 4 h 后始可做第二次试验。
(5) 试验时,气雾柜(室)必须保持密闭,设有空气过滤装置,以防染菌空气外逸,污染环境。
(6) 试验时,气雾柜、气雾室或现场房间应防止日光直射,以免造成杀菌作用不稳定。
(7) 气雾柜排风过滤装置中的滤材应定期更换，换下的滤材应经灭菌后再作其他处理。
(8) 在气雾柜或密闭房间内进行消毒剂喷雾消毒时, 用悬挂染菌样片法观察的消毒效果, 不能代表对空气的消毒效果。
2.1.4 生活饮用水消毒效果鉴定实验技术
2.1.4.1 生活饮用水消毒效果鉴定
2.1.4.1.1 目的
检测生活饮用水消毒剂与消毒器械的杀菌效果, 以作为评价消毒剂与消毒器械对生活饮用水消毒能否达到卫生合格标准的参考。
2.1.4.1.2 试验器材
(1) 大肠杆菌 (8099) 悬液。取 37℃ 培养 18h～24 h 的新鲜大肠杆菌斜面,用生理盐水洗下菌苔，混匀后再用生理盐水适当稀释，配制成试验用大肠杆菌悬液。
(2) 微孔滤膜滤器和滤膜(滤膜孔径为 0.45μm～0.65 μm,滤膜大小示滤器型号确定,目前常 用有直径为 35 mm 和 47 mm 两种)。
(3) 抽滤水泵或气泵。
(4) 恒温水浴箱。
(5) 秒表。
(6) 三角烧瓶。
(7) 广口玻璃瓶 ( 500 ml)。
(8) 无齿镊子。
(9) 品红亚硫酸钠培养基：见附录A。
(10) 中和剂(鉴定合格者,见 2.1.1.2.5 )。
(11) 细菌定量杀灭试验用其他器材(见 2.1.1.2.7 )。
(12) 天然水样。
(13) 模拟现场消毒装置(见 2.1.4.2 )。
(14) 磁力搅拌器。
2.1.4.1.3 试验阶段
饮用水消毒效果的鉴定应经过实验室杀菌试验, 天然水样消毒试验两个阶段的检测。实验室试验的目的是以大肠杆菌为试验菌, 用悬液定量杀菌试验法测出在试管中消毒所需的剂量。天然水样消毒试验是由自然水体取样, 进一步验证受试消毒剂或方法对成分较复杂的天然水的消毒效果。对用于较大水体(如人工游泳池水、高层建筑二次供水)消毒的设备和方法, 必要时尚需进行模拟现场或现场试验, 以进一步验证其消毒效果。
由于生活饮用水的卫生标准, 除微生物外还需考虑化学污染等方面, 因此对其安全评价尚需由有关专业单位对其他条件,例如化学物质含量和 pH 值等, 进行检测和判定, 以对所鉴定的消毒剂或器械做出合格与否的综合评价。
2.1.4.1.4 试验菌污染水样的配制
试验用试验菌污染水样用于试验室消毒试验。配制时,将用生理盐水配制的大肠杆菌悬液加入脱氯的自来水或蒸馏水中,使其含菌量达到 5 ′ 104 cfu/100ml～5 ′ 105 cfu/100ml。
2.1.4.1.5 试验菌污染水样中活菌的培养计数
(1) 将纤维滤膜在蒸馏水中煮沸消毒 3 次,每次 15 min。每次煮沸后需更换蒸馏水洗涤 2～3 次,以除去残留溶剂。
(2) 将滤器用用压力蒸汽灭菌( 121℃,20 min )，也可用酒精火焰灭菌。
(3) 用无菌镊子夹取无菌的滤膜边缘,将粗燥面向上,贴放在已灭菌滤器的滤床上,稳妥地固定好滤器。取一定量待检水样(稀释或不稀释)注入滤器中，加盖,打开抽气阀门,在负压0.05 Mpa 下抽滤。
(4) 水样滤完后,再抽气约 5s,关上滤器阀门,取下滤器。用无菌镊子夹取滤膜边缘,移放在品红亚硫酸钠琼脂培养基平板上,滤膜截留细菌面向上。滤膜应与琼脂培养基完全紧贴,当中不得留有气泡,然后将平板倒置,放入 37℃ 恒温培养箱内培养 22h～24h。
(5) 观察结果和计数:计数滤膜上生长带有金属光泽的黑紫色大肠杆菌菌落,并计算出染菌水样中含有的大肠杆菌数 (cfu/100ml )。
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