消毒技术规范（七）

2.3.6.1  目的

    检测消毒剂重复接触后对试验动物产生的皮肤变态反应。

2.3.6.2 试验动物

    选用皮肤完好的健康白色豚鼠，雌雄各半，体重200g～300g。

2.3.6.3 试验分组

    将豚鼠随机分为试验组、阴性对照组和阳性对照组，每组动物至少16只。

2.3.6.4  操作程序

    (1)对试验组豚鼠，给予受试物诱导和激发处理。阳性对照组给予阳性致敏物(如：2，4-二硝基氯苯)诱导和激发处理。阴性对照组仅给以激发接触。

    (2)诱导接触浓度允许引起皮肤轻度刺激反应。激发浓度应低于诱导浓度，不得引起原发刺激性反应。如果原液不引起皮肤刺激反应，诱导和激发均使用原液。

    (3)于试验前24h将豚鼠背部左侧3cm×3cm范围内剪毛。取诱导浓度的消毒剂溶液(或原液)0.2ml，滴在 2cm×2cm两层纱布上，并将其敷贴在左侧去毛区。用一层无刺激塑料膜或油纸复盖，再以无刺激胶布固定，持续 6h。第 7d 和第 14d以同样方法重复一次。

    (4)在末次诱导后14d，将激发浓度的消毒剂溶液0.2ml滴在2cm×2cm的两层纱布上，敷贴于豚鼠背部右侧 3cm×3cm去毛区。然后，用一层塑料膜或油纸和无刺激胶布固定，6h后将敷贴的受试物洗去。24h和48h后观察皮肤反应，按表3-9皮肤反应的评分标准评分。

(5)实验室开展皮肤变态反应试验初期，或使用新的动物种属或品系时，需同时设阳性对照组，阳性对照物可使用2，4-二硝基氯代苯。为保证试验方法的可靠性，在进行该类试验时，每隔半年应使用阳性对照物检查一次。若检测报告中需用非本次阳性对照组的实验数据时，尚需注明其实验日期。阳性对照组的操作程序同试验组，以阳性致敏物替代受试物。

    (6)阴性对照组，仅对动物给予激发接触。

2.3.6.5  评价规定

    化学物质引起的过敏性接触性皮炎，属迟发型变态反应。对于动物，仅见皮肤红斑和水肿。

根据表2-19标准，将出现皮肤反应(评分≥1)的动物数除以该组实验动物数，求得致敏率(%)，按表2-20评定致敏强度。

 

             A  红斑形成:

                 无红斑                                           0

                 轻微红斑                                         1

                 中度红斑                                         2

                 严重红斑                                         3

                 水肿性红斑                                       4

             B  水肿形成:

                 无水肿                                           0

                 轻度水肿                                         1

                 中度水肿                                         2

 

 

 

 

 

        0～8                                                         极轻度

        9～28                                                        轻度

       29～64                                                        中度

       65～80                                                        强度

注：致敏率为0%时，可判为未见皮肤变态反应。

2.3.7.1 目的

    （1）检测消毒剂多次接触对实验动物的蓄积毒性作用及其靶器官，并确定其最大未观察到有害作用剂量和最小观察到有害作用剂量。

（3）为亚慢性、慢性毒性或致癌试验的剂量设计提供依据。

2.3.7.2 实验动物

一般用啮齿类动物，首选大鼠。所用大鼠应为6周龄～8周龄，每组至少10只，雌雄各半。试验开始时同性别体重差异应不超过平均体重的20%。

2.3.7.3 试验分组

将实验动物随机分为4组（3个剂量组和1个对照组）。选择受试物剂量时，高剂量组应出现明显的毒性反应，但不引起死亡，如果出现动物死亡应不超过10%；中间剂量组应可观察到轻微的毒性反应；低剂量组应不引起任何毒性反应（属未观察到有害作用剂量）。至于具体的剂量设计，可考虑高剂量为LD₅₀的1/5～1/10，高、中、低3个剂量间的组距以3倍～5倍为宜，最低不小于2倍。另以受试物溶剂代替受试物进行试验，作为阴性（溶剂）对照组。

2.3.7.4 操作程序

    （1）采用灌胃方式经口染毒。

    （2）灌胃法每天灌胃一次，每周称体重，并按体重调整受试物的给予量。

    （3）试验期为28d～30d，末次染毒后24h处死实验动物，检测各项指标。

2.3.7.5 观察指标

可因消毒剂毒理作用不同而有差异，一般至少包括下列各方面。

（1）       临床检查：观察动物中毒表现，每周称量体重一次。

（2）       血液学检查：包括血红蛋白含量、红细胞数、白细胞数及其分类计数等。

（3）液生物化学检查：如天冬氨酸氨基酸转移酶、丙氨酸氨基转移酶、尿素氮、肌酐、血清总蛋白和白蛋白、总胆固醇等。必要时，可根据所观察到的受试物毒性效应，或与受试物化学结构相似物质的毒性作用，选择其它一些生化指标。

（4）脏器重量：测量肝、肾绝对重量和脏器系数。

（5）毒理学检查：实验结束时，处理所有动物，进行全面的肉眼尸检，并将尸检发现的异常组织和主要脏器和组织（如心、肝、肾、脾、脑、肾上腺、睾丸、卵巢和胃肠等）固定保存。当各剂量组动物尸检未发现明显病变时，先进行高剂量组和阴性对照组动物的肝、肾、胃肠和其它可能受损的脏器的组织病理学检查。如发现病变，还应对中、低剂量组动物相应的器官进行组织病理学检查。

2.3.7.6 评价规定

    将各试验组动物观察指标与阴性对照组加以比较并进行统计学检验，注意各剂量组间的剂量-反应（效应）关系。评定受试动物的最小观察到有害作用剂量和最大未观察到有害作用剂量及最大未观察到有害作用剂量及毒性作用的靶器官。

2.3.8.1.1 目的

    检测消毒剂对体外培养的哺乳动物细胞的基因突变作用，以作为评价消毒剂致突变性的依据。

2.3.8.1.2 试剂 

     （1）F_10P培养液: 为完全培养液。以Fischer培养液，加入马血清10%，丙酮酸钠220μg/ml， 青霉素100IU/ml和链霉素100μg/ml配制而成(pH值7.2～7.4)。于4℃ 冰箱中保存备用。   

    （2）F_0P培养液:为无血清培养液。以Fischer培养液，加入丙酮酸钠220μg/ml，青霉素100 IU/ml和链霉素100μg/ml等配制而成(pH值7.2～7.4)。于4℃冰箱中保存备用。

    （3)马血清:将过滤除菌后的马血清，经56℃作用30min灭活补体。分装后，于-20℃保存备用。

    （4)集落用培养基:用Fischer培养液，加入马血清20%、丙酮酸钠220μg/ml、琼脂0.37%配制而成。

    （5）无钙镁磷酸盐缓冲液(无钙镁PBS，pH为7.2～7.4):

    磷酸二氢钾(KH₂PO₄)          0.20g

    磷酸氢二钠(Na₂HPO₄.12H₂O)   2.89g

    氯化钾(KCl)                0.20g

    氯化钠(NaCl)               8.00g

    双蒸水(压力蒸汽灭菌)       1000ml

    （6)受试物:最好能直接溶于F_10P与F_0P培养液中。否则需先溶于二甲基亚砜(DMSO)，而后再加于上述培养液内。所加 DMSO的量应低于1%(V/V)。

    （7)阳性对照物:选用甲基磺酸乙酯(EMS)，丝裂霉素C(MMC)，甲基硝基亚硝基胍   (MNNG)，苯并(a)芘 (BaP) 等。

    （8）三氟胸苷(TFT):用生理盐水配成100μg/ml溶液，可冻存3个月。

（9）肝微粒体酶混合液(S9 混合液):取健康的雄性成年SD或Wistar大鼠3 只，体重150g 左右，约5周龄～6周龄。将多氯联苯(Aroclor 1254)，溶于玉米油中，浓度200mg/ml，按500mg/kg体重一次腹腔注射。5d后，断头处死动物，取出肝脏称重后，用预冷的0.15mol/L 氯化钾溶液冲洗肝脏数次。每克肝(湿重)加0.15mol/L氯化钾溶液3ml。剪碎肝脏，在冰浴中用玻璃匀浆器制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。

    将肝匀浆用低温(0℃～4℃)高速离心机，以 9000g离心10min。取上清液即为S9，分装于无菌冷冻安瓿中。S9制成后，需进行无菌检查，以及用间接致癌物鉴定其活性。合格者置-80℃或液氮中储存备用，储存期不超过一年。

    S9混合液应以上述S9 液在临用时按无菌要求配制。一般配成含10% S9的混合液。其配方如下：

    S9                                                0.10ml

    1.65mo1/L氯化钾 + 0.4 mol/L 氯化镁                0.04ml

    葡萄糖-6-磷酸.2Na                                 1.8mg

    氧化型辅酶 II (NADP)                              3.1mg

    用F_0P培养液补足至 1.0ml

2.3.8.1.3  细胞

试验以小鼠淋巴瘤L5178Y细胞[胸苷激酶(TK) 座位为杂合子 (tk+/tk-)] 检测 TK 基因的突变。为减少细胞的自发突变率，在制备该细胞试验用悬液时，先将其在加有 THMG 的 F_10P 培养液中培养24h，杀灭培养液中所存在的自发突变细胞 (tk-/tk-)，然后将细胞悬浮于THG 培养液(不含氨甲喋呤的 THMG 培养液)中培养 1d～3d。

    [THMG 含下列4种成分， 各成分的终末浓度如下:

       胸苷      5×10^-6 mol/L

       次黄嘌呤  5×10^-5 mol/L

       氨甲喋呤  4×10^-7 mol/L

       甘氨酸    1×10^-4 mol/L]

2.3.8.1.4 试验分组

    一般设4个剂量组。对有细胞毒性的受试物，最高剂量的细胞存活率为10%～20%，无细胞毒性受试物最高剂量不超过10mmol/L或5mg/ml。同时应有阴性（溶剂）对照组、未处理对照组和阳性对照组。除未处理对照组外，试验组和其它对照组，还均应包括有加S9 混合液和不加S9 混合液两大部分。

2.3.8.1.5 操作程序

    (1)细胞准备:将新清除了自发突变体的细胞群体，用F_10P培养液制成悬液。以无菌烧瓶加入细胞悬液和F_10P 培养液至100 ml，细胞终末密度为7×10³个/ml～8×10³ 个/ml。培养物以含5%二氧化碳的空气充气后，加盖密闭，于37℃进行振荡培养。L5178Y细胞的细胞殖周期约为10h～11h，在常规培养24h后，细胞数将增加约5倍。用稀释法维持生长，每天将细胞培养物用F_10P 培养液作4倍稀释(或隔天用F_10P培养液作24倍稀释)，继续培养。实验前一天用F_10P培养液和F_0P 培养液各50% 的对半混合液(马血清终末浓度为 5%) 稀释。

    (2)受试物处理:用上述F_10P和F_0P 的对半混合液将细胞培养物稀释至 1×10⁶ 个/ml，并分种于50ml有盖试管中，每管6ml，再加S9混合液4ml(总量共10ml)。不加S9 混合液管，代之以F_0P培养液。在上述试管内加入一定浓度的受试物，并以含5%二氧化碳的空气充气后加盖密闭，于37℃振荡培养4h。

    处理结束后，以200g 离心10min，除去含受试物的上清液，收集细胞。细胞用Hanks液洗涤，再加入20mlF_10P培养液充分混悬(细胞浓度为 0.3×l0⁶ 个/ml)，以含 5%二氧化碳的空气充气后，加盖密闭，于37℃ 振荡培养，开始表达。

    (3)表达:细胞的表现型表达时间为2d。表达开始后24h和48h经计数后将细胞稀释至3  ×10⁵ 个/ml。

    (4)选择和集落化:表达结束后，取10ml 培养物经离心后除去大部分上清液。并将细胞在留下的约1mlF_10P培养基中混悬。将细胞悬液移入含100ml 集落培养基的烧瓶中。此时细胞密度为3×l0⁴个/ml。在37℃振荡培养 30min。取出 0.5ml 后，向余下的细胞悬液中加入 1.0ml TFT 贮存液，继续振荡培养15min。将样本取出，倒于3 个10cm平皿中，每平皿33ml，含1×l0⁶个细胞(称为TFT 平板)，作突变体的选择。将先前取出的0.5ml细胞悬液用集落培养基先作1:100稀释，细胞悬液浓度为3×l0² 个/ml。振荡培养15min 后，取出2.0ml 再用集落培养基作 1:50 稀释(此时细胞悬液浓度为 6个/ml) 后振荡培养。经 15min培养后，倒入3个直径为100mm的平皿中，每平皿33ml，含细胞200个(称为VC平板)。待琼脂凝固后，置二氧化碳培养箱(37℃)中静置培养 10d。计数各个平皿中出现的集落数，计算集落形成效率(CFE)。

(5)阳性与阴性对照组的操作程序同试验组，仅阳性对照组用阳性对照物代替受试物，阴性(溶剂)对照组用受试物溶剂代替受试物。另设一未处理对照组。                                                                     

(6) 按下列公式计算有关指标:

 

    绝对 CFE = (形成集落数 / 接种细胞数)

    相对 CFE = (试验组绝对CFE / 溶剂对照组绝对CFE) × 100%

    突变频率 (MF) = (TFT平皿集落数 / VC平皿集落数) × 稀释系数

[在此，稀释系数为 2×l0^-4。]

 

2.3.8.1.6  评价规定

    (1)对 L5178Y 细胞，推荐可接受的自发突变频率范围为 20～100/10⁶（个）存活细胞。

    (2)用适当的显著性检验方法进行统计学处理，当各剂量组 MF与阴性(溶剂)对照组者相比，有显著性意义的增加，并呈剂量-反应关系时，或仅一个剂量组有统计学意义的增加并经重复试验证实者，均可判为阳性结果，即受试物对L5178Y 细胞 TK 系统有致突变性。

2.3.8.2.1  目的

    检测消毒剂对体外培养的哺乳动物细胞可否引起基因突变，以对消毒剂的致突变性做出评价。

2.3.8.2.2  试剂 

    (1)完全培养液: 以Eagle最低必需培养液(EMEM)或F₁₂培养液加10%小牛血清、青霉素  (100IU/ml) 和链霉素 (100μg/ml) 配制而成。

    (2)小牛血清:将过滤除菌后的小牛血清放入56℃水浴中，保温30min以灭活补体， 而后分装，保存于-20℃备用。

(3)无钙镁磷酸盐缓冲液(无钙镁PBS):见2.3.8.1.2（5)。   

(4)胰蛋白酶-EDTA溶液:分别用无钙镁 PBS 配制胰蛋白酶与EDTA 溶液，胰蛋白酶溶液浓度为0.05%，EDTA溶液浓度为0.02%。两溶液按1:1混合。存放于-20℃ 备用。

    (5)受试物: 最好能直接溶于无血清培养液内。否则，需先溶于二甲基亚砜(DMSO)， 而后加于无血清培养液内。所加DMSO溶液量为0.5%(V/V)。

    (6)阳性对照物:可根据受试物的性质和结构选用不同的阳性对照物，例如甲基磺酸乙酯(EMS)，丝裂霉素C(MMC)，甲基硝基亚硝基胍(MNNG)，苯并(α)芘(BaP)等。

    (7)6-硫代鸟嘌呤(6-TG): 用0.5% 碳酸氢钠溶液配制为1.0mg/mL 溶液，保存于4℃备用。

    (8)肝微粒体酶混合液(S9混合液)见2.3.8.1.2（9）。

    (9)姬姆萨染液: 取姬姆萨染料3.8g，置玛瑙乳钵中，加少量甲醇研磨。逐渐加甲醇至375ml，待完全溶解后，再加125ml甘油，放入37℃温箱中保温48h。保温期间振摇数次，使充分溶解。取出过滤，两周后使用，作为姬姆萨染液原液。

    使用时，取1份姬姆萨染液原液，与9份1/15mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8) 混合，配成其应用液。

    磷酸盐缓冲液(1/15mol/L，pH6.8)配制方法如下:

    第一液:取磷酸氢二钠9.47g溶于蒸馏水1000ml中，配成1/15mol/L溶液。

    第二液:取磷酸二氢钾49.07g溶于蒸馏水1000ml中，配成1/15mol/L溶液。

    取第一液49.5ml加于第二液50.5ml中混匀，即为pH6.8的1/15mol/LPBS。

2.3.8.2.3   细胞

    以中国仓鼠肺(V79) 细胞株进行试验。为减少其自发突变，正式试验前将野生型细胞接种于含THMG(见2.3.8.1.3)的MEM培养液内并在二氧化碳培养箱中培养一周，以杀灭自发 HGPRT位点突变体。遂后重新接种于MEM培养液中。

2.3.8.2.4  试验分组

    一般设4个试验剂量组。对有细胞毒性的受试物，最高剂量组的细胞存活率为10%～20%，无细胞毒性受试物最高剂量不超过10mmol/L(或5mg/ml)。同时，应设阴性（溶剂）对照组、未处理对照组和阳性对照组。除未处理对照组外，各组均应包括加S9 混合液和不加该液的样本。

2.3.8.2.5  操作程序               

    (1)细胞准备:将5×10⁵ 个细胞接种于含完全培养液的直径为100mm的平皿中，于二氧化碳培养箱中(37℃)培养24h。

    (2)接触受试物: 将细胞培养物吸去培养液，用无钙镁 PBS洗2次。将细胞悬液分为两组，一组加S9混合物，一组不加S9混合物。加S9 混合物者，一般在8ml 细胞悬液中加入2ml S9混合液(共10ml)，对不加S9混合物者，则代之为2ml 无血清培养液。阳性和阴性(溶剂)对照组亦分加与不加S9混合物两组，操作方法同上。另设一未处理的阴性对照组。

    细胞悬液中加入S9混合物的同时，还加入无血清培养液及一定浓度的受试物。将样本置二氧化碳培养箱中5h。处理结束后，吸去含受试物的培养液，用无钙镁PBS 洗细胞2次，再加入完全培养液，在二氧化碳培养箱中培养19h～22h。

    (3)表达: 将培养物用胰蛋白酶-EDTA 消化。待细胞脱落后，加入完全培养液，终止消  化。混匀、计数并进行表达和细胞毒性测定见2.3.8.2.5（4）。表达时，以 5×10⁵ 个细胞接种于直径为100mm的平皿中。培养3d后，分传一次，仍接种5×10⁵ 个细胞，培养3d后再进行突变体的选择及集落形成效率(CFE)的测定。

    (4)细胞毒性测定:将上述消化计数后的细胞，每平皿接种200个，每组5个平皿，于二氧化碳培养箱内(37℃)培养7d。取出样本，固定并进行姬姆萨染色后，计数各平皿的细胞集落数。以相对CFE值表示细胞的毒性。

    (5)突变体的选择及集落形成率的测定: 表达结束后，消化细胞，分别接种，每组5 个平皿，每平皿种2×10⁵个细胞。待细胞贴壁后加入 6-TG，终末浓度为 5μg/ml。放入二氧化碳培养箱培养7d～10d。固定后进行姬姆萨染色，计数平皿内集落数，并计算其突变频率(MF)。

　  (6)阳性与阴性对照组的操作程序同试验组，仅阳性对照组用阳性对照物代替受试物，阴性(溶剂)对照组用受试物溶剂代替受试物。另设一阴性(未处理)对照组。

(7)按下列公式计算有关指标:

 

绝对 CFE = (形成集落数/接种细胞数)

    相对 CFE = (试验组绝对CFE/溶剂对照组绝对CFE) × 100%

突变频率 (MF) = (突变集落数/接种细胞数) ×（1/绝对CFE）

 

2.3.8.2.6  评价规定

    (1)对V79 细胞，推荐可接受的自发突变频率范围为0～20/10⁶（个）存活细胞。

    (2)用适当的显著性检验方法进行统计学处理，当各剂量组MF与阴性(溶剂)对照组者相比，有显著性意义的增加，并呈剂量-反应关系时，或仅一个剂量组有统计学意义的增加并经重复试验证实者，均可判为阳性结果，即受试物对 V79 细胞 HGPRT 系统有致突变性。

2.3.8.3.1  目的

    用细胞遗传学方法检测体外培养的哺乳动物细胞染色体畸变，评价消毒剂的致突变性。

2.3.8.3.2  试剂

    (1)完全培养液:  采用 Eagle最低必需培养液(EMEM)或Dulbecco 最低必需培养液  (DMEM)等， 并加入 10%小牛血清以及青霉素(IU/ml) 和链霉素(100μg/ml)。

    (2)小牛血清:将过滤除菌后的小牛血清，放人56℃恒温水浴中，保温30min灭活补体。处理后分装，保存于-20℃备用。

    (3)无钙镁磷酸缓冲液[无钙镁PBS，pH为7.2～7.4。见2.3.8.1.2 (5)]。

    (4)胰蛋白酶-EDTA:见2.3.8.2.2 (4)。

    (5)受试物: 最好能直接溶于无血清完全培养液内。否则，需先溶于二甲基亚砜(DMSO)，而后加于完全培养液内。所加DMSO溶液量应低于1.0%(V/V)。

    (6)阳性对照物：加S9时选用环磷酰胺等，不加S9时选用丝裂霉素C等。

    (7)肝微粒体酶混合液(S9 混合液):见2.3.8.1.2(9)。   

    (8)秋水仙素溶液(0.04%)：取40mg秋水仙素溶解于100ml无菌0.85%氯化钠溶液中，过滤除菌。

(9)氯化钾溶液(0.075mol/L)。

(10)甲醇/冰醋酸(3:1，V/V) 固定液: 临用现配。

(11)姬姆萨染液: 见2.3.8.2.2 (9)。

2.3.8.3.3  细胞

    可选用中国仓鼠肺CHL细胞、中国仓鼠肺 V79 细胞、中国仓鼠卵巢 CHO 细胞，或人外周血淋巴细胞等进行试验。

    在一般情况下，本试验推荐使用CHL细胞。使用CHL 细胞时，在试验前一天，将其1×l0⁶ 个细胞接种于直径为100mm平皿中，置37℃二氧化碳培养箱内待用。

2.3.8.3.4  试验分组

    所设试验剂量组应不少于4个。最高剂量组的细胞存活率应为10%～20%，无毒性受试     物最高剂量组不超过10mmol/L(或5mg/ml)。同时，应设阴性(溶剂)对照组、未处理对照组和阳性对照组。除未处理对照组外，各组均应包括加S9混合液和不加该液的样本。

2.3.8.3.5  操作程序

    (1) 试验时，吸出细胞培养平皿中的培养液，加入试验所规定浓度的受试物和S9混合物(10%) 以及不含小牛血清的完全培养液，放二氧化碳培养箱内作用2h。结束后，吸去完全培养液，用Hanks液洗细胞3次。加完全培养液，再置二氧化碳培养箱中培养，于24h收获细胞。收获细胞之前2h～4h，加入秋水仙素溶液(终末浓度为1μg/ml)，阻断细胞于有丝分裂中期相。

(2)收获细胞时，用胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞，待细胞脱落，加入培养液并混匀以终止胰蛋白酶作用。离心(1000r/min～1200r/min，5 min～7min)，弃去上清液后，加入0.075mol/L氯化钾溶液低渗处理10 min～20min。离心后，再以甲醇/冰醋酸液固定2次。按常规滴片干燥，用姬姆萨应用液染色15min 左右。

    (3)阳性与阴性对照组的操作程序同试验组，只是阳性对照组用已知染色体断裂剂替代受试物。阴性(溶剂)对照组用受试物的溶剂。另设一未处理对照组。

    (4)观察：每组各选100个染色体分散良好的中期分裂相细胞，进行染色体畸变分析，观察和记录染色体结构的异常及数量异常。

    染色体结构异常可有：断裂，微小体，有着丝点环，无着丝点环，单体互换，双微小体，裂隙，非特定性型变化(粉碎化等)。染色体数量异常可有:非整倍体，多倍体，内复制。

2.3.8.3.6  评价规定

    用χ² 检验或其他适当的显著性检验方法，对所得试验数据进行统计学处理。当各剂量组与阴性(溶剂)对照组相比，畸变细胞率有显著性意义的增加，并有剂量-反应关系时；  或仅一个剂量组有显著性意义的增加，并经重复试验证实时，可判为该受试物在本试验中具有致突变性。

2.3.8.4.1 目的

    检测消毒剂对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成的影响，评价消毒剂的遗传毒性。

2.3.8.4.2  试剂

    (1)受试物: 常用水、植物油，或用0.5%羧甲基纤维素钠配制成混悬液。

    (2)阳性对照物: 常用环磷酰胺或丝裂霉素C。

    (3)小牛血清:见2.3.8.3.2 (2)。

    (4)姬姆萨染液:见2.3.8.2.2 (9)。

2.3.8.4.3  试验动物

    选用体重为25g～30g的小鼠50只，雌雄各半。

2.3.8.4.4  试验分组

    受试物至少设3个剂量组，每个剂量组用10只动物，雌雄各半。另设阴性(溶剂)和阳性对照组。剂量组一般取受试动物的1/2LD₅₀、1/5LD₅₀、1/20LD₅₀等剂量，以得到剂量-反应关系曲线。高剂量组应不引起动物死亡，不引起骨髓抑制。若采用一次最大限度试验时，测得 LD₅₀大于5000mg/kg体重，即以5000mg/kg体重为高剂量。

2.3.8.4.5  操作程序

    (1)动物染毒用经口灌胃30h 染毒法，即两次染毒间隔24h，第二次染毒后6h取材。

    (2)用颈椎脱臼法处死动物，取股骨或胸骨。剥除肌肉，擦净血污。切断股骨或胸骨两端，暴露骨髓腔。

    (3)用注射器吸取0.1ml小牛血清，冲洗骨髓腔。用冲洗液常规涂片，晾干或热风吹干。

    (4)将已干的涂片，在甲醇中固定5 min～10min。用姬姆萨应用液染色10 min～15min，然后用pH6.8PBS 液冲洗，晾干。

    (5)阳性与阴性对照组的操作程序同试验组。阳性组选用环磷酰胺(40mg/kg体重)或丝裂霉素(1mg/kg体重～1.5mg/kg体重)。阴性(溶剂)对照组用受试物溶剂。

    (6)选择细胞分布均匀、完整、着色适当的区域。在油镜下计数含微核的嗜多染红细胞   (PCE)数。PCE呈灰蓝色[成熟红细胞(NCE)呈粉红色]，微核多呈圆形、单个、边缘光滑、整齐，嗜色性与有核细胞核质一致，呈紫红色或蓝紫色。直径通常为红细胞的1/20～1/5。

    (7)每只动物计数1000个PCE。微核细胞率指含有微核的PCE数，以千分率表示。一个PCE中出现有两个或多个微核，仍按一个计数。此外，还应观察PCE/NCE 比例，作为对细胞毒性的指标。一般以计数200个PCE所见到的NCE。当PCE/NCE小于0.1时，提示对骨髓具有抑制作用，应降低受试物剂量，重新进行试验。

2.3.8.4.6  评价规定

    阴性对照组小鼠，微核细胞率一般不超过 0.3%。

    用波松分布 u 检验或其他适当的显著性试验方法，进行统计学处理。当各剂量组与溶剂对照组相比，微核细胞率有显著性意义的增加，并有剂量-反应关系，或仅一个剂量有显著性意义的增加并经重复试验证实时，均可判为受试物具有体内遗传毒性。

2.3.8.5.1  目的

    用细胞遗传学方法检测实验动物骨髓细胞染色体畸变率，以评价消毒剂的致突变性。

2.3.8.5.2  试剂

    (1)阳性对照物: 常用环磷酰胺，或丝裂霉素C。

    (2)秋水仙素(0.04%):取40mg秋水仙素溶解于100ml无菌的0.85% 氯化钠溶液中，过滤除菌。

    (3)氯化钾溶液(0.075mol/L)。

    (4)甲醇/冰醋酸(3:1，V/V)固定液:临用现配。

    (5)姬姆萨染液：见2.3.8.2.2 （9）。

    (6)磷酸盐缓冲液(PBS，1/15mol/L，pH7.4)。

2.3.8.5.3  试验动物

    成年小鼠(体重25g～30g)，或大鼠(体重180g～220g)。动物总数不少于30只，雌雄各半。

2.3.8.5.4  试验分组

    随机分为5组。至少3个受试物剂量组，为1/2LD₅₀、1/5LD₅₀、1/20LD₅₀。若采用一次最大限度试验时，测得LD₅₀大于5000mg/kg体重，即以5000mg/kg体重为高剂量。另设阳性对照组和阴性(溶剂)对照组，每组6只动物，雌雄各半。阳性对照组可用环磷酰胺(40mg/kg体重) 或丝裂霉素C(1.5mg/kg体重～2mg/kg体重)。阴性(溶剂)对照组采用受试物溶剂。

2.3.8.5.5  操作程序

    (1)用经口灌胃方式，共染毒两次，间隔24h。于第二次染毒后6h处死动物。处死动物前2～4h腹腔注射0.04%秋水仙素溶液，剂量为4mg/kg体重。

    (2)用颈椎脱臼法处死动物，取出股骨，剔除肌肉等组织。

    (3)剪去股骨两端，用注射器吸取5ml生理盐水，从股骨一端注入，用10ml离心管从股骨另一端接取流出的骨髓细胞悬液。

    (4)将骨髓细胞悬液离心(1000r/min，5 min～7min)，除上清液。加0.075mol/L 氯化钾溶液7m1，用滴管将细胞轻轻混匀，置37℃水浴中低渗处理7min。

    (5)加入2ml甲醇/冰醋酸固定液，混匀。离心(1000r/min，5min～7min)，弃上清液。再加入7ml固定液，混匀，固定7min。离心(1000r/min，7min)，弃去上清液。

    (6)用同法再固定1次～2次，弃上清液，加入数滴新鲜固定液，混匀。

    (7)用悬液滴片，晾干，以姬姆萨应用液染色。

    (8)每组各选100个染色体分散良好的中期分裂相细胞，进行染色体畸变分析，观察和记录染色体结构的异常和数量的异常。染色体结构异常可有:断裂、微小体、有着丝点环、单体互换、双微小体、裂隙、粉碎化等。染色体数量的异常可有:非整倍体、多倍体、内复制等。

    (9)计算畸变细胞率。畸变细胞率为100个中期分裂相细胞中有染色体畸变的细胞数。一个中期分裂相细胞出现两种或多种畸变，仍按一个有染色体畸变细胞计。

    (10)阳性与阴性(溶液)对照组的操作程序同试验组。只是阳性组选用环磷酰胺(40mg/kg   体重)或丝裂霉素(1.5mg/kg体重～2.0mg/kg体重)作为受试物的替代物。阴性(溶剂)对照组用受试物溶剂作为受试物的替代物。

2.3.8.5.6  评价规定

    用χ² 检验，或其他适当的显著性检验方法对所得试验数据进行统计学处理。当各剂量组与阴性(溶剂)对照组相比，畸变细胞率有显著性意义的增加，并有剂量-反应关系时；或仅一个剂量组有显著性意义的增加，并经重复试验证实时，可判为该受试物在本试验中具有致突变性。

2.3.8.6.1   目的

    检测受试物，是否可引起体外哺乳动物细胞的原发 DNA 损伤。推荐用放射自显影法进行测定。

2.3.8.6.2 试剂

     (1)完全培养液:用Eagle最低要求培养基(EMEM)85份加小牛血清15 份，青霉素 (终末浓度100IU/ml)与链霉素(终末浓度100μg/ ml)，pH为7.2～7.4。过滤除菌后，保存于4℃冰箱备用。

    （2）同步培养液:用不含精氨酸的EMEM培养基 98 份，加小牛血清 2 份，再加青霉素(终末浓度100IU/ml)与链霉素(终末浓度为100μg/ml)配制而成。

    （3）小牛血清:见2.3.8.2.2 (2)。

    （4）无钙镁磷酸盐缓冲液(无钙镁PBS):见2.3.8.1.2 (5)。

    （5）胰蛋白酶-EDTA溶液:见2.3.8.2.2 (4)。

    （6）甲醇/冰醋酸(3:1，V/V) 固定液:临用现配。

    （7）羟基脲(HU)贮备液:250mmol/L。

    （8）1% 枸橼酸钠溶液。

    （9）³H-胸腺嘧啶核苷

    （10）NTB-2 核乳胶或国产核-4乳胶。

    （11）肝微粒体酶混合液(S-9混合液):见2.3.8.1.2 （9)。

    （12）显影液及定影液:包括柯达(Kodak)D-196显影液、停显液及 F-5 定影液。

2.3.8.6.3   细胞

    可选用人成纤维细胞、大鼠原代肝细胞、外周血淋巴细胞等进行试验。本规范推荐使用人胚肺成纤维细胞(2BS)。

2.3.8.6.4  试验分组

    受试物可分4个剂量组。最高剂量组应使细胞存活率在10%～20%之间。无毒性受试物组最高剂量不超过10mmol/ml。同时应有阴性 (未处理、溶剂) 对照组和阳性对照组。

2.3.8.6.5  操作程序

    人胚肺成纤维细胞(2BS)放射自显影法操作程序。

    (1)将细胞增殖至所需数量后，用完全培养液制成单细胞悬液，浓度为0.5×10⁵个/ml～1.0×10⁵个/ml。将细胞悬液接种置有小盖玻片的6孔细胞培养板中，在37℃二氧化碳培养箱内培养1d～3d，至细胞50% 融合。每一剂量组和各对照组分别作2个～3个平行样本。

    (2)换用同步培养液，培养 3d。

    (3)在试验的前一日下午，加入羟基脲(HU)贮备液使HU的终末浓度为10mmol/L。继续在37℃下培养16h，然后将上述长有细胞之盖片置于含有不同浓度的受试物、HU(10mmol/L) 及³H - 胸腺嘧啶核苷(5μCi/ml～10μCi/ml，30Ci/mmol)同步培养液中。在37℃培养培养5h。

    (4)阳性及阴性对照组的操作程序同试验组，只是阳性对照组用阳性对照物代替受试物，阴性(溶剂)对照组用受试物溶剂代替受试物。

    (5)处理结束后，用Hanks液洗涤3次，再用1%枸掾酸钠溶液处理10min。将小盖玻片用甲醇-冰醋酸固定液固定30min，重复2 次。干燥过夜，将有细胞的盖玻片用少量中性树胶，粘固于载玻片上，长有细胞的一面朝上。

    (6)在暗室中，将适量之NTB-2乳胶(或核-4乳胶)移入浸渍用之玻璃器皿中，置40℃水浴中融化，再加入等量40℃蒸馏水，继续在水浴中加温，用玻璃棒轻轻搅拌10 min～20 min， 使气泡逸出。同时将准备做自显影处理的载玻片，置水浴箱平台上预热。而后，将附有样本的载玻片垂直浸渍于乳胶液中约5s。提出玻片，拭去其背面乳胶并待其干固。

    (7)将干固的附有样本的载玻片置于有变色硅胶干燥剂袋的曝光盒中，盒外包黑色避光 纸，于4℃冰箱中曝光10d。曝光后，将玻片在D-19显影液中显影4min，在停显液中漂洗30s，在F-5定影液中定影10min，再用水漂洗数小时。

    (8)将细胞在显影后用姬姆萨染液染色，脱水透明后，用盖片封固。在油镜下，计数各样本细胞核的显影银粒数，每个样本计数100个细胞， 同时计数相当面积的本底银粒数， 两者之差为细胞核净银粒数。计算各试验组和对照组"银粒数/核"的均值及其标准差。

2.3.8.6.6  评价规定

    用t检验或其他适当的显著性检验方法进行统计学处理。当各试验剂量组"银粒数/核" 均值与阴性(溶剂)对照组者相比，有显著性意义的增加，并呈剂量-反应关系时，或仅一个剂量组有统计学意义的增加，但经重复试验证实者，可判为该受试物诱导了DNA修复合成，具有遗传毒性。

2.3.8.7.1  目的

    以哺乳动物体内试验，检测受试物对雄性生殖细胞的遗传毒性(精子形态异常)。

2.3.8.7.2  试剂

    (1)受试物: 常用水、植物油，或用0.5%羧甲基纤维素钠配制成混悬液。

    (2)阳性对照物:常用环磷酰胺或丝裂霉素C。

    (3)甲醇（优级纯）。

    (4)2.5%伊红溶液:称取伊红2.5g，溶于 100 ml蒸馏水中备用。

2.3.8.7.3  试验动物

    成年雄性小鼠至少25只，体重25g～35g。

2.3.8.7.4  试验分组

    设3个试验剂量组，最高剂量可取最大耐受量，或分别取1/2LD₅₀、1/5LD₅₀、1/20LD₅₀。若采用一次最大限量试验时，测得LD₅₀大于5000mg/kg体重，即以5000mg/kg体重为高剂量。另设阳性对照组和阴性(溶剂)对照组。每组 5 只动物。

2.3.8.7.5  操作程序

    (1)小鼠灌胃染毒。连续 5d，每天 1 次。

    (2)首次染毒后 35d，用颈椎脱臼法处死动物，剖腹，取出附睾。

    (3)将附睾放入盛有2ml生理盐水的平皿中，用眼科剪剪碎。以3层擦镜纸过滤，取滤液离心(1000r/min，5min)。

    (4)除上清液。加入少量生理盐水，以混悬液涂片。自然干燥。甲醇固定5min，用伊红溶液染色1h。

    (5)在高倍显微镜下，每只动物计数1000个精子中的畸形精子数。精子畸形类型可分为无钩、香蕉形、胖头、无定形、尾折叠、双头、双尾等。分别记录其畸变类型，以统计精子畸形率及精子畸形类型的构成比。     

    (6)阳性对照组，腹腔注射环磷酰胺(每天40 mg/kg体重～60mg/kg体重)，或丝裂霉素C(每天1.0mg/kg体重～1.5mg/kg体重)。阴性对照组为受试物溶剂对照。其他操作程序同试验组。

2.3.8.7.6  评价规定

    用χ² 检验， 或其他适当的显著性检验方法对所得试验数据进行统计学处理。当各剂量组与阴性(溶剂)对照组相比，精子畸形率有显著性意义的增加，并有剂量-反应关系时； 或仅一个剂量组有显著性意义的增加，并经重复试验证实时，可判为该受试物对雄性生殖细胞具有遗传毒性。

2.3.8.8.1  目的                                   

    利用细胞遗传学方法，以哺乳动物体内试验检测受试物引起的生殖细胞染色体损伤。试验有小鼠精原细胞染色体畸变试验和小鼠精母细胞染色体畸变试验，可根据情况选做其一，或两者均做。

2.3.8.8.2  试剂

    (1)受试物: 溶于水、植物油，或用 0.5% 羧甲基纤维素钠制成混悬液。

    (2)阳性对照物: 常用环磷酰胺，或丝裂酶素。

    (3)秋水仙素(0.04%):取40mg秋水仙素，溶于100ml 0.85% 氯化钠溶液中，过滤除菌。

    (4)甲醇/冰醋酸(3:1，V/V)固定液:临用现配。

    (5)枸掾酸三钠。

    (6)姬姆萨染液:见2.3.8.2.2 (9)。

2.3.8.8.3 试验动物

    选用3月龄～4月龄，体重25g～30g 的雄性小鼠。动物总数不少于25 只。

2.3.8.8.4  试验分组

    受试物至少设3个试验剂量组，每个剂量组5只动物。另设阳性对照组和阴性(溶剂)对照组。阳性对照组用环磷酰胺(40mg/kg体重) 或丝裂霉素C(1.5mg/kg体重～2mg/kg体重)，腹腔注射。

2.3.8.8.5  操作程序

    (1)小鼠精原细胞染色体畸变试验，用经口灌胃方式，共染毒两次，间隔24h。于第二次染毒后6h处死动物。处死动物前3.5h～5.0h腹腔注射0.04%秋水仙素溶液，剂量为4mg/kg体重。

小鼠精母细胞染色体畸变试验，灌胃染毒，每天1次，连续5d。于第1次染毒后的第12d～14d将受试动物处死。处死动物前3.5h～5.0h，腹腔注射0.04% 秋水仙素溶液(4mg/kg体重)。

    (2)用颈椎脱臼法处死小鼠，取睾丸，去除脂肪。置含2.2%枸橼酸三钠溶液平皿中去除睾丸被膜，用针头使曲精小管松散。一个动物的2个睾丸可分别或合并处理。

    (3)用吸管尽可能去除2.2% 枸橼酸三钠溶液，将曲精小管置于含3ml～4ml 低渗液(1% 枸  橼酸三钠)的试管中。10min后更换低渗液，以去除碎片和精子。在室温下，低渗时间总计不超过25min。低渗结束后去除低渗液。加入预冷的固定液(甲醇/冰醋酸)，固定10min后，更换固定液，再固定10min。第3次固定至少30min，也可在冰箱中过夜。用镊子将已固定的曲精小管移到含50%醋酸5ml的离心管中，吸管吹打至不透光，离心(1000r/min，5min)。

    (4)将固定液1.0 ml～1.5ml加至离心所得细胞沉淀物中。滴管吹打后，滴2 滴至用70% 乙醇浸湿的玻片，分散后，热风干燥。

    (5)用姬姆萨应用液在室温染色10min，自来水淋洗两次。

    (6)以油镜检查染色体结构的异常情况。每只动物做两个睾丸，每个睾丸分析50个中期分裂相精原细胞(或精母细胞)。记录观察染色体型和染色单体型染色体的结构异常。对精母细胞染色体还观察相互易位、X-Y和常染色体的单价体。

    检查染色体数目异常时，记录非整倍体和多倍体。在小鼠精母细胞染色体畸变试验时，只有当第一次减数分裂中，四倍体生殖细胞有一个被确认为四价体时才有意义。

2.3.8.8.7  评价规定

用χ² 检验，或其他适当的显著性检验方法对所得试验数据进行统计学处理。当各剂量组与阴性(溶剂)对照组相比，畸变细胞率有显著性意义的增加，并有剂量-反应关系时； 或仅一个剂量组有显著性意义的增加，经重复试验证实后，可判为该受试物对哺乳动物睾丸细胞具有致突变性。

2.3.9.1  目的

    (1)检测消毒剂较长期染毒对试验动物的毒性作用及其靶器官，并确定其最大未观察到有害作用剂量。

    (2)为慢性毒性和致癌试验的剂量设计提供依据。

    一般用啮齿类动物，首选大鼠。所用大鼠应为 4周龄～6 周龄者。全部试验至少需用 80 只动物。

2.3.9.3  试验分组

    将试验动物随机分为4组(3个剂量组和1个对照组)，每组20只动物，雌雄各半。选择受试物剂量时，高剂量组应出现明显的毒性反应，如果出现动物死亡应不超过 10%；中间剂量组应可观察到最小的毒性效应；低剂量组应高不引起任何毒性效应 (属未观察到有害作用剂量)。至于具体的剂量选择，可考虑高剂量为LD₅₀的1/20~1/5，高、中、低3个剂量间的组距以3倍~5倍为宜，最低不小于2倍。另以受试物溶剂代替受试物进行试验，作为阴性对照组。

2.3.9.4  操作程序

    (1)采用灌胃方式或将受试物掺入饲料经口染毒。

    (2)灌胃法每天灌胃一次，每周称体重，并按体重调整受试物剂量。

    (3)试验期为3个月(90d)，末次染毒后24h 处死试验动物，检测各项指标。

2.3.9.5  观察指标   

必须包括体重、主要脏器病理组织学检查。一般可选择几项指标，于实验结束时进行检查。至于具体指标，因消毒剂毒理作用不同，不宜做具体规定。以下几个方面可供选择指标时参考。

    (1)一般表,现。观察动物中毒表现，每周称量体重一次。

    (2)血液学检查。包括血红蛋白含量、红细胞数、白细胞及其分类计数、血小板数、网织红细胞数等。

    (3)血液生物化学检查。例如天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、尿素氮、肌酐、血清总蛋白和白蛋白、空腹血糖、总胆固醇、总胆红素等。必要时，可根据所观察到的受试物毒性效应，或与受试物化学结构相似物质的毒性作用，选择其他一些生化指标。

    (4)脏器重量。测量主要脏器(如心、肝、肾、肺、脾等)的脏器重量系数。

    (5)病理学检查。实验结束时，处死所有动物，进行尸检，并将主要器官和组织（如心、肝、肾、脾、脑、肾上腺、睾丸、卵巢和胃肠等）固定、保存。当各剂量组动物尸检未发现明显病变时，先进行高剂量组和阴性对照组动物肝、肾及其它重要的和可能受损的脏器的组织病理学检查。如发现病变，还应对中、低剂量组动物相应的器官进行组织病理学检查。

2.3.9.6  评价规定

将各试验组动物观察指标与阴性对照组加以比较并进行统计学检验，注意各剂量组间的剂量-反应关系。评定受试物最小观察到有害作用剂量和最大未观察到有害作用剂量及其毒性作用的靶器官。

2.3.10.1  目的

    检测消毒剂对试验妊娠动物有无致畸胎性，确定其未观察到发育毒性的剂量。

2.3.10.2  试剂

    （1）1/1000茜素红溶液:茜素红0.1g，氢氧化钾10g，加蒸馏水1000m1。

    （2）透明液A:甘油200ml，氢氧化钾10g，蒸馏水790ml。

    （3）透明液B:甘油与蒸馏水等量混合。

    （4）固定液(Bouins液):苦味酸饱和液75份，甲醛20份，冰醋酸5份。

2.3.10.3  试验动物

    试验用大鼠或小鼠 (必要时可用家兔)。用大鼠和小鼠试验时，取健康、性成熟、未交配过的体重为200g～250g的大鼠，或体重为25～30g的小鼠。

2.3.10.4  试验分组

    将试验动物至少设4组，其中3个为试验组，1个为阴性对照组。每组至少有15只孕鼠。高剂量组可用雌鼠的1/10LD₅₀作为试验剂量；低剂量组，可用雌性动物的 1/100LD₅₀作为试验剂量。其间设中剂量组。阴性对照组以受试物的溶剂代替受试物进行试验。阳性对照组常用阿司匹林(300mg/kg体重)、敌枯双(1mg/kg体重)或维生素A(40000IU)。对于实验室首次进行的物种或品系应设阳性对照组。

2.3.10.5  操作程序

    （1）将雌鼠和同龄的雄鼠按 1:1 或 2:1 的比例同笼饲养。每日晨观察阴栓(或阴道涂片)。查出阴栓或精子的当天定为孕期零天。如5d内未交配，调换雌鼠。查出的孕鼠按上述随机分组，并进行称重和编号。

（2）在大、小鼠孕期6d～15d期间，每天用灌胃法给予受试物。分别于孕期0d、6d、10d、15d和19d称重孕鼠，并根据体重计算受试物剂量。注意观察并记录孕鼠的毒性反应。

    （3）大鼠于孕期第20d，或小鼠于孕期第18d，用颈椎脱臼法处死。剖腹，取出子宫称重，检查活胎、吸收胎、早期死胎和晚期死胎数。

    （4)逐个记录活胎鼠的性别、体重、身长和尾长。外观检查头面部、躯干部、四肢等有无畸形，诸如露脑、脑膨出、眼部畸形(无眼或开眼等)、鼻孔扩大、单鼻孔、唇裂、脊柱裂、四肢和尾畸形、肛门闭锁等。

    (5)每窝取约1/2活胎鼠～2/3活胎鼠，用眼科镊剥皮。取出内脏(注意勿拉断肋骨)，去掉后颈和两肩胛骨之间的脂肪块。将胎鼠放入茜素红溶液染色。当天摇动玻璃瓶2次～3次。待骨骼染成红色时为止。将胎鼠换入透明液A中1d～2d，换入透明液B中2d～3d。待胎鼠骨骼已染红，而软组织的紫红色基本褪去，可换置甘油中。

    (6)将染好的标本连同甘油一并倒入含水平皿内，在解剖显微镜下，用透射光源，先观察胎鼠全身，然后逐步检查:①头骨、胸骨、脊椎骨、肋骨和四肢等有无骨化不全、骨化迟缓和其他缺陷。②观察脊椎骨有无缺失、融合、纵裂等畸形；③观察胸骨的发育和数目，有无胸骨缺失等；④检查肋骨有无融合肋、分叉肋、肋骨中断、缺肋、短肋、波状肋、多肋畸形等；⑤最后检查四肢骨畸形。

    (7)每窝取约 1/3活胎鼠～1/2 活胎鼠浸入固定液2 周，作内脏检查。将已固定的胎鼠用水冲净，仰放于石蜡板上。剪去四肢和尾，用刀片在头颈部常规共切4刀，再用剪刀剖开胸、腹腔。着重检查:①有无裂舌、双叉舌、裂腭及眼、鼻和脑部的畸形；②是否出现右位心、心脏过大、肺过大或过小等畸形；③ 消化系统和泌尿生殖系统各器官的大小、形状以及位置；  ④ 有无肾盂积水，双侧有无睾丸，以及子宫发育不全等畸形。

2.3.10.6  评价规定

    主要观察动物畸胎出现率，同时观察其他指标，如着床数、活胎数、晚期死胎数、早期死亡数，以及活胎体重、身长、尾长等。

    观察全部结果的剂量-反应关系，确定受试物的母体毒性、发育毒性及致畸性。求出受试物的最小致畸剂量和最大无致畸作用剂量。对致畸强度应以致畸指数表示。

    致畸指数 = (雌鼠LD₅₀)/(最小致畸剂量)

致畸指数小于或等于10为基本不致畸；大于10至100为致畸；大于100为强致畸。

2.3.11.1  目的

    检测受试物长期染毒对试验动物所产生的毒性作用，确定其最小观察到有害作用剂量，最大未观察到有害作用剂量及毒性作用的靶器官。

2.3.11.2  试验动物

    试验选用刚离乳的大鼠。在试验结束时，每个剂量组每种性别的动物应不少于10只。

2.3.11.3  试验分组

    将试验动物随机分在3个剂量组和1个阴性对照组。若在试验中对受试物使用溶剂或赋形剂时，阴性对照组应给予相应剂量的溶剂或赋形剂。试验剂量根据亚慢性试验结果选择。最高剂量应引起明显的毒性效应或损害作用，最低剂量应不引起毒性效应。

2.3.11.4  操作程序

    （1）用灌胃法或将受试物掺入饲料中或饮水中喂饲。掺入饲料的受试消毒剂的最高浓度一般不超过5%。饲料中受试消毒剂应定期监测，观察其均匀性和稳定性。

    （2）灌胃法每天给药一次。

    （3）前3个月每周称量体重，3个月后每月称一次体重，调整受试物灌胃量。每周称一次饲料消耗量。如受试物溶于饮水中饲喂，需记录动物的饮水量。

    （4）试验期限一般为6个月，必要时可延长至2 年。

2.3.11.5  观察指标

指标与亚慢性毒性试验基本相同，也可根据受试物对实验动物的亚慢性毒性作用和靶器官，可适当增加或更换一些针对性更强更灵敏的观察指标。

(1)临床观察：观察动物中毒表现，体重前3个月每周称量一次，以后每月1次。

(2)血液学检查：于试验的第3个月、6个月及以后每半年进行一次血液学检查。

(3)血液生物化学检查。检查时间同血液学检查。

（4）病理学检查：

1）系统解剖：所有实验动物包括试验过程中死亡的动物都应进行完整的系统解剖和详尽的肉眼观察。肉眼可见的异常组织都应留样作进一步组织病理学检查。

    2）脏器重量：称区脑、肝、肾、肾上腺和睾丸重量并计算脏器系数。

    3）组织学检查：对照组、高剂量组动物及系统解剖发现异常的组织均应作详尽的组织学检查。当高剂量组有异常发现时，其它剂量组才进行相应检查。检查脏器一般包括心、肝、肾、脾、脑、肾上腺、睾丸、甲状腺、垂体、卵巢、子宫胃和肠等。

2.3.11.6 评价规定

比较各剂量组与对照组观察指标的变化。计算分析其剂量-反应关系，并确定受试物最小观察到有害剂量和最大未观察到有害作用剂量，及毒性作用靶器官。

2.3.12.1  目的

    检测长期接触消毒剂后试验动物出现肿瘤的情况，评价其致癌性。也可将致癌试验和慢性毒性试验结合在一批动物中进行。

2.3.12.2  试验动物

    以刚离乳的大鼠或小鼠进行试验。如与慢性毒性试验结合进行，通常选用大鼠。 各剂量组和阴性对照组使用的动物量，至少雌雄各50只。如与慢性毒性结合进行，试验中间需处死动物进行检查时，需相应增加实验动物数。

2.3.12.3  试验分组

    试验动物分组同慢性试验，一般设3个剂量组与1个阴性对照组(见 2.3.11.3)。根据亚慢性试验结果选择剂量。最高剂量组为最大耐受剂量，可引起轻度毒性效应，但不能因肿瘤以外因素明显缩短其生命期限。最低剂量组应不影响动物正常的生长、发育和寿命，即不引起任何毒性效应。中间剂量处于最高和最低剂量之间。若在试验中对受试物使用溶剂或赋形剂时，阴性对照组应以相应的溶剂或赋形剂进行试验。

2.3.12.4  操作程序

    （1)将受试物灌胃或掺入饲料或饮水中饲喂。掺入饲料中的受试物最高浓度，不应超过 5%。如用灌胃法，每天给药一次。

    （2)每周称体重并调整给予的受试物剂量。试验期应包括动物正常寿命期的大部分时间，大鼠为2年以上，小鼠为18个月以上。

    （3)试验过程中，着重观察动物的肿瘤发生情况。对每一肉眼可见或可触及的肿瘤，其出现的时间、部位、大小、外形和发展情况均应有记录。

    （4)凡在试验过程中死亡或濒死而提前处死，以及试验结束全部处死的动物，均应进行完整的尸检及主要器官和组织的病理学检查。当发生肉眼可见肿瘤或可疑病变组织的动物，对试验过程中死亡或濒死而提前处死的动物，高剂量组和对照组的全部动物，均需进行病理组织学检查。如果高剂量组肿瘤、癌前病变或增生的发生率和阴性对照组者相比，差别有显著性时，则中、低剂量组所有动物的有关器官和组织亦均需进行病理组织学检查。

    （5）若致癌试验和慢性毒性试验结合一起进行，还应观察慢性毒性试验中其它指标。

2.3.12.5  评价规定

    （1）肿瘤发生率：肿瘤发生率是整个实验终了时，患瘤动物总数在有效动物总数中所占的百分率，有效动物总数是指最早出现肿瘤时的存活动物总数。

 

         

    （2）致癌试验阳性的判断标准

    按世界卫生组织(WHO，1969)提出的下列 4条致癌试验阳性标准进行评价：

    1）阴性对照组动物出现的一种或数种肿瘤， 试验组均有发生且发生率超过前者。

    2）试验组发生阴性对照组未有的肿瘤。

    3）试验组肿瘤发生的时间早于阴性对照组者。

4)试验组每个动物的平均肿瘤数超过阴性对照组者。

（3）       致癌试验阴性结果的确立

假若动物试验规模为两种种属、两种性别，至少3个剂量，其中一个接近最大耐受剂量，每组动物致少50只，实验组肿瘤发生率与对照组无差异。

（4）试验报告：在结果报告中，应写明所发现肿瘤的部位、数量、性质、癌前病变，其它毒性效应，以及剂量反应关系及统计学分析结果。

2.3.13.1 第一阶段和第二阶段试验结果的判定

    （1）在急性经口毒性试验中，LD₅₀＞5000mg/kg体重，可安全使用；对于稀释使用的消毒剂,当LD₅₀≤5000mg/kg体重时，则需增做消毒剂最高应用浓度5倍的急性经口毒性试验。增做的试验结果，如果LD₅₀＞5000mg/kg体重，可通过；否则，需做第三阶段亚慢性试验。

（2）在亚急性毒性试验中,如最高剂量（1/5 LD₅₀～1/10 LD₅₀）未观察到毒性作用可通过，否则根据试验的最小观察到有害作用剂量和最大未观察到有害作用剂量（以mg/kg计），再参考消毒剂的毒性作用特点和使用条件，由专家评定。

（3）在急性吸入毒性试验中，LC₅₀＞10000mg/m³ 者，属于实际无毒，可通过。

（4）在皮肤刺激试验中，如结果为无刺激或仅具轻度刺激作用，可通过。否则，应放弃使用。

（5）在急性眼刺激试验中，如结果对眼未见刺激性或具有轻度刺激，可通过。否则,应放弃使用。

（6)在阴道黏膜刺激试验中，如结果对阴道黏膜无或极轻刺激性，可通过。否则，应放弃使用。

    （7）在皮肤变态反应试验中，如消毒剂对皮肤具有轻度或轻度以上致敏作用，应放弃使用。

    （8）致突变试验结果的判定：对第一类消毒剂所进行的分别反映基因水平、体细胞染色体水平和性细胞染色体水平的3种类型致突变试验中，如有2种或3种类型试验结果为阳性，该消毒剂应放弃，不必继续进行试验。如果仅一种类型试验为阳性，应再增做另一项同类型致突变试验。若其结果仍为阳性，该消毒剂亦应放弃使用。

    对第二类消毒剂所进行的分别反映基因水平和染色体水平类型的两项致突变试验中，如均为阳性,该消毒剂应放弃使用，不必继续进行试验。若仅一种类型试验为阳性，应再增做另一项同类型致突变试验,如结果为阴性,可通过；否则需进入第三阶段或第四阶段试验。

    对第三类消毒剂所进行的反映基因水平或体细胞染色体水平类型一项致突变试验中，如结果为阴性，可通过；如结果呈阳性，应再增补另一种类型的一项致突变试验，尚仍为阳性，该消毒剂应放弃使用。

2.3.13.2 第三阶段试验结果的判定

    根据亚慢性毒性试验和致畸试验中的最小观察到有害作用剂量和最大未观察到有害作用剂量(以 mg/kg体重计)，再参考消毒剂的毒理作用特点，由专家评定。

2.3.13.3 第四阶段试验结果的判定

根据慢性试验中的最小观察到有害作用剂量和最大未观察到有害作用剂量(以mg/kg计)，或在任何一个剂量组发现有致癌作用，均需由有关专家评议作出结论。

2.3.13.4 以上各项为消毒剂安全性毒理学评定的基本原则。对特殊情况，应由有关专家评议作出结论。

 

              

 

1.磷酸盐缓冲液 （PBS，0.03mol/L，pH7.2）

无水磷酸氢二钠                    2.83g

磷酸二氢钾                        1.36g

蒸馏水加至                        1000ml

将各成分加入到 1000ml 蒸馏水中,待完全溶解后,调  pH  至 7.2,～7.4,于 121℃ 压力蒸气灭菌 20min备用。