性传播感染疾病实验诊断研究的重要性

熊礼宽

性病在我国已经成为一个重要的公共卫生问题，全国性病疫情报导数据显示，2003年我国累计报导性病病例数（HIV/AIDS除外）73万[1]。自1999年以来，性病发病率居高不下，其发病率在传染病中位居第3位。随着实验医学的发展，性病的防治已经历了从经典性病（4种）、现代性病（8例）到性传播感染疾病（STI）防治模式的转变[2]。因此，性传播感染疾病诊断研究应引起高度重视。
一、 梅毒
梅毒血清学检测一直是梅毒实验诊断的主要方法，包括初筛试验和确认试验。初筛试验主要是性病研究实验室应用性病实验研究试验（VDRL）、快速血浆反应素（RPR、TRUST）试验。由于存在假阳怕和假阴性，假阳性主要是自身免疫性疾病、传染性疾病和妊娠等等因素所致，假阴性主要是早期，晚期梅毒以及前带现象。因此，在梅毒筛查试验时，应同时进行原样和1：2滴度稀释检查。确诊试验包括血清荧光密螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）、血凝试验（TPHA）、明胶颗粒凝集试验（TPPA）、免疫渗透法（胶体金或硒标记）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹试验和FTA-ABS-19SIgM检测等，其检测抗体采用重组抗原日益增多，以提高其诊断的特异性和敏感性[2，3]。FTA-ABS、TPHA或TPPA主要用于梅毒的确诊，不适用于疗效考核。VDRL和RPR（TRUST）可用于疗效考核，ELISA适用于血源筛查，特异性和敏感性与TPHA或TPPA相似，免疫印迹试验可用于特异性IgM、IgG检查，初步临床研究表明，特异性IgM可用于诊断新生儿（先天性）梅毒[3]。免疫渗透法（胶体金或硒标记）不同产品批间差异较大[4]，评价后使用。螺旋体检查适用于硬下疳和梅毒皮疹，脑脊液阳性率低。
二、 细菌感染
1． 淋病：男性急性淋病的实验诊断可采取涂片见革兰染色为阴性的细胞内肾型双球菌，慢性淋病涂征形态不典型，且并非存在于细胞内，阳性率又低，应进行培养，鉴定或/和定量PCR技术等分子生物学技术检测[2]。女性淋病由于其泌尿生殖道存在其它奈瑟菌属，因此最好进行培养鉴定或/和定量PCR技术检测。由于淋病奈瑟菌（NG）耐药率不断增高，其耐药性监测和β内酰酶监测在性病防治中起着非常重要的作用。NG感染的分子生物学诊断主要是核酸杂交技术、连接酶链反应（LCR）、实时荧光定量PCR技术、COBAS Amplicor和探针技术。核酸杂交技术自20世纪80年代开始用于NG感染检测。从同位素标记NG隐蔽性质粒开始，到目前的非放射性的地高辛、生物素及吖啶橙化学发光标记的耐药质粒DNA探针、染色体DNA探针及rRNA探针。Digene HC2检测NG/CT敏感性和特异性分别为94.8%和99.8%[5].
免疫荧光试验由于采用不同单抗差异较大,目前尚不推荐用于NG感染的临床实验诊断.
2.软下疳:其病原体杜克雷嗜血杆菌.在感染1周内细菌在局部繁殖.形成疼痛性溃疡,比时涂片可见革兰阴性球杆菌,呈“鱼群状”排列.其营养要求苛刻,一般培养阳性率为40%~90%,以兔血琼脂、GCHgS培养基和Mueller-Hinton培养基（均含3ug/ml万古霉素）最佳[2]。5%的CO2潮湿环境33℃培养24~48h，取可疑菌落进行染色镜检。2002年Patterson等采用杜克雷嗜血杆菌血红蛋白受体（HgbA）单抗和免疫层析技术检测杜克雷嗜血杆菌。特异性100%，敏感性为2×106CFU[6]。
细菌性阴道病：其由加特纳菌引起的阴道菌群平衡失调所致。目前主要靠线索细胞、胺试验、pH测定和加特纳菌培养、鉴定。此外，阴道分泌物存在脯氨酸氨基肽酶和唾液酸酶活性升高（BV Blue快速检测试剂）[7]，由此诊断细胞性阴道病敏感性和特异性分别为94.5%和92.9%.
三、 沙眼衣原体
细胞培养为诊断衣原体（CT）感染的“金标准”，常用McCoy和HeLa229细胞，敏感性为80%~90%，受标本的采集、传送条件、培养细胞及标本中抑制物等影响[2]。
抗原检测：主要是直接免疫荧光染色（DFA）、酶标法和免疫层析法。酶标法主要是采用酶标的单抗检测衣原体脂多糖（LPS）或外膜蛋白（MOMP、OMP2），其特异性好、敏感性高，且简便、快速、适合于大时标本检测，特别是双表位（单抗Bc2和Bc5为针对L2和L3血清型CT的MOMP）ELISA一步法，可同时检出非淋菌性尿道炎（宫颈炎）和性病淋巴肉芽肿[8]。免疫层析法（胶体金标准记技术）由于敏感性低，且不同公司试剂或同一公司试剂或同一公司试剂批间差异大，但由于其简便、快速，因此，仅用于小区或基层单位使用，我们正在参与WHO组织的多中心评价研究。
分子生物学检测主要有实时荧光定量PCR、LCR、转录介导扩增试验（TMA）和COBAS Amplocor试验等[9]。实时荧光定量PCR一般扩增CT共有质粒、16sRNA基因和MOMP基因（ompl），多以CT/NG同时检测为优，2004年Molano采用PCR-反抽线性杂交（reverse line blot，RLB）检测ompl基因VD2区，可检测CT9种血清型（Ba、D、E、F、G、H、I、J和K）[10]。
性病淋巴肉芽肿病原体为血清型L1、L2和L3，涂片姬姆萨和巴帕尼科拉乌（papanicolaou）染色，可见细胞内包涵体，但敏感性不高，性病淋巴肉芽肿也可用荧光标高沙眼衣原体血清型L1-3单抗体进行免疫荧光染色镜检[2]。
四、支原体感染
以往研究认为，与STI相关的支原体有脲原体（Ureaplasma，U）和人型支原体（Mycoplasma hominis，MH）。但目前研究表明，生殖器支原体（Mycoplasma genitalium）和脲原体在STI中起着重要作用[11]。原脲原体分为2个生物型，生物型1由血清型1、3、6和14组成，生物型2由血清型2、4、5、7~13组成。1998年将脲原体生物型1和2分别定交为微小支原体（U.parvum）和解脲脲原体（U.urealyticum）。而MH与细菌性阴道病，盆腔炎，产乳热和妇科感染有关。此外，艾滋病相关支原体主要有发酵支原体（M.fermentans）和渗透支原体(M.penetrans).但商业化泌尿生殖道支原体培养、鉴定和药敏试剂盒由于没有进行固体培养或过滤转种鉴定，只能作为泌尿生殖道支原体过筛试验，以此判断支原体感染，将有20%的假阳性，且不能鉴别为何种支原体；由于取材没有定量，结果中大于104的可靠性也就差，特别是经过规范治疗后解尿素尿素原体培养长期阳性者，应进行固体培养或过滤转种培养，同时进行生化反应鉴定，支原体药敏最好采用向量法测定最低抑菌浓度（MIC），其液体培养基可采用SP4，现在在研究采用16S rRNA基因检测支原体属，以其可变区V3和V5分型的快速诊断支原体感染[12]。
五、 病毒感染
1． HIV感染的实验室诊断[13]：绝大多数HIV感染可以通过检测HIV1+2 IgG抗体诊断。早期感染和胎儿感染的诊断采用检测HIVp24抗原或DNA的方法。HIV病毒载量测定则用于治疗效果的监控，而不用于感染的诊断。AIDS的疗效考核选用CD4+、CD8+和T细胞受体剪切环（TREC+）纯真细胞[13]。（1）抗体的筛选和确证试验：筛选试验包括EIA、OraQuick快速检查试验（OraSure公司）、明胶颗粒凝集试验等，EIA应用广泛，已发展为双抗原夹心法（第三代）和同是检测抗体与p24抗原法（第四代）从而大大缩短检测窗口期，确证实验包括免疫印记法、免疫斑点（线性）杂交和复合单克隆抗体EIA。（2）核酸检测：利用PCR技术检测外周血单核细胞内HIV，国内分析病毒载量技术有竟争逆转转录酶PCR、NASBA和bDNA技术等，可评价临床治疗效果、检测病毒药性，已广泛用于AIDS治疗。
病毒培养：主要用于HIV研究，需P3实验室，故仅限于HIV研究实验室。
2． HSY感染的实验诊断[13]：2/3HSV感染者为无症状排毒状态，必须借助实验诊断。HSV2型的生殖器感染逐渐增加，且两型复发的可能性和频率各异，故有必要进行HSV分型检测。（1）HSV培养：为金标准方法，但不同的临床标本检出率不同。如斑丘疹、水泡、脓泡、溃疡、结痂检出率分别为25%、94%、87%、70%和27%[4]。（2）抗原检查：是目前最常用的实验诊断方法。免疫荧光法和酶免疫法检测标本中HSV抗原，敏感性为70%~90%，特异性为90%~100%。（3）HSV抗体试验：HSV特异性糖蛋白G是检测型特异性的基础，G2用于HSV2诊断，而G1用于HSV1。1周内就可检出血清中抗HSV-2型gB、gD、VP5、gC/E的IgG、IgM、IgA抗体，但原发笥生殖疱疹抗体水平低，目前美国FDA已有批准的商品试剂供应，由于几乎所有HSV2感染是通过性行为感染，因而HSV2抗体可提示肛周生殖品感染，但HSV1抗体出现无法与口腔感染辨别，所以抗体检测主要用于流生病学调查和原发性感染的回顾性诊断，对于恢复期或复发性感染意义不大，且各种检测试剂重量差异较大。（4）PCR检测HSV的敏感性：对原发性生殖器疱疹和脑脊液HSV感染有确诊价值。近来复合PCR同时检测HSV、梅毒螺旋体和杜克雷嗜血杆菌，尚处于研究阶段。
3． 人类乳头瘤病毒（HPV）感染的实验室诊断：目前发现有30多型HPV可引发生殖器和肛门部位尖锐湿疣（CA），其中HPV-6，11主要引起生殖器疣，而16、18型主要与宫颈癌变有关。典型的CA临床易于诊断，而多数为非典型皮损、亚临床感染及潜伏感染或与类似疾病相鉴别时，必须进行HPV感染的实验诊断以帮助临床确诊。
免疫组化和原位杂交法可分别直接检测组织中HPV抗原和核酸并可进行分型，但操作繁琐且敏感性较低。反向斑点（或线型）杂交技术是近处来用于鉴定HPV型别的技术。右同时检测高危型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68共13种，低危型6、11、42、43、44共5种，提高了重迭感染的检测率[14-16]。限制性片段长度多态性技术（RFLP）是用限制性内切酶消化HPV的扩增产物，由于酶切位点的不同DAN片段长度会有差异，再通过凝胶电泳分离这些片段，由此来判断HPV的型别。限制性内切酶主要有RsaI、HaeIII、PstI、DdeI等，常见各型HPV均可用RFLP方法区分，并能通过RFLP鉴别新的致病的HPV类型，但混合感染时结果不易判断。
PCR-ELISA依所检测的HPV基因型的不同，该法检测HPV的灵敏度可达10~200拷贝[15]，但该法不能鉴定为哪一型HPV感染，并且需要的PCR产物量较大。2002年Roda等[16]采用一种新型的聚乙稀微孔板，该板有24个主孔，每个主孔又含有7个小孔，可同时检测7种HPV基因型，同时使PCR产物的用量大为减少。
实时定量PCR（RQ-PCR）法是最敏感的核酸扩增技术之一[17]，由于避免了PCR后的产物分析，可在较短的时间获得结果，且可对其DNA进行定量分析，有助于了解病毒载量与疾病的关系。
4． 其它性传播病毒[13]：肝炎病毒、巨细胞病毒（CMV），疱疹病毒8型（HH-8）均可通过性行为感染，甲肝病毒（HAV）最常见传播方式是粪-口途径，常见于吸毒和同性恋人群。乙肝病毒（HBV）可以通过皮肤或黏膜接触含病毒的体液传播，据报导成人异性性传播占40%，同性恋间传播占15%；丙肝病毒（HCV）是否存在性传播尚存在争议。CMV感染通常为无症状感染，存在于精液和宫颈分泌物性传播感染，由于感染数月后开始排毒，故早期诊断不宜选用病毒培养，常用ILISA法。HHV-8是一种与卡波肉瘤有关的新病毒。近年研究发现，在同性恋间传播-性病高危人群血清阳转率26。5%。目前尚无体外培养方法，通常用EIA或PCR方法检测。COBAS Amplicor系统包括检测多重NG/CT外，还右检测CMV、HBV、HCV、HIV和HIV载量以及结核分枝杆菌[9]。
六、真菌感染
通过性传播感染的真菌主要是念珠菌，引起男性和女性生殖器感染，实验诊断包括湿片和革兰染色显微镜检查，但阳性率低，临床上应进行念珠菌培养，由于不同的念珠菌药敏试验结果不同。因此，念珠菌鉴定和药敏试验亦十分重要。由于显色培养基使用简便、结果判断准确，用于鉴定白念珠菌、平滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌的正确率达90%。故已被国内处广泛使用[18]。
七、寄生虫感染
阴道毛滴虫感染主要采取生理盐水涂片，但其阳性率低，特别是男性患者和无症状的女性患者，目前培养仍然为诊断滴虫病的“金标准”，其培养基有Diamond，改良Diamond、改良Thiohlycolate和InPonch等，尽管InPouch TV培养基阳性率高于Diamond，改良Diamond、改良Thioglycolate培养基，但由于需要2~7d，所以PCR 技术在滴虫病的诊断应用中有广阔的前景，目前，用于滴虫病诊断研究的引物主要有阴道毛滴虫铁还原蛋白基因TVA5/6、BTUB9/2、TVK3/7和AP65A/B等，但其特异性和敏感性还有待于进一步评价。2004年Xenotope公司Xenostrip-Tv免疫层析法诊断阴道毛滴虫感染方法简便。适用于阴道毛滴虫流生区[19]。
总之。随着分子生物技术进展，CT/NG同时检测已进入临床实验室[5，9]，不久的将来，实时荧光多重PCR 技术同时快速诊断生殖器溃疡，PCR-RLB进行CT、HPV、支原体检测和分型以及检测STI病原体耐药基因芯片将进入临床检测。

摘自：《中华检验医学杂志》2004年12月第12卷第12期