随着基因工程和蛋白质工程的发展，原则上人们已经可以根据需要生产各种特殊用途的蛋白质，但在下游工程中常见的问题就是蛋白在重组表达系统中异常折叠和聚集沉淀以包涵体形式存在，给研究和应用都带来了诸多不便。如何使蛋白的包涵体重新折叠成具有天然构象的蛋白，是基因工程和蛋白质工程亟待解决的问题 [1] 。此外，一些神经退化性疾病如老年性痴呆、亨廷顿舞蹈病等也与蛋白的不正确折叠及沉淀有关。如能解决这一问题，将会对外源蛋白的功能性表达、研究亨廷顿舞蹈病等疾病发病机制与治疗措施以及蛋白质的体外定向改造、功能基因组的研究等具有重要的应用价值。
影响蛋白质折叠的因素虽然极为复杂，但根据Anfinsen原则，高级构象最终取决于一级结构。一级结构中蛋白质的平均电荷、形成转角的氨基酸残基数、半胱氨酸和脯氨酸数才是影响蛋白折叠和包含体形成的重要因素，有时甚至一个氨基酸的改变就能极大的改变蛋白质折叠的进程，降低包涵体的形成。我们从改造序列出发，将复杂的问题简单化。由于新生肽链中N端对于折叠的具重要作用[2]，将目的蛋白与报告蛋白的N端融合在一起，如果N端外源蛋白能够正确折叠，势必带动其后的报告蛋白正确折叠，利用报告蛋白活性与目的蛋白溶解性之间的这种相关性[3]，在原核表达系统中建立报告系统，采用直观可见的筛选标记，对蛋白的折叠状态进行指示。希望通过这样一个简便、通用、快捷的遗传筛选模型能对蛋白折叠进行定性、定量分析，进而以蛋白聚集体为靶点为蛋白折叠相关的疾病的诊治提供一个稳定的平台。
1 材料与方法
1.1
材料
1.1.1
菌株及质粒 受体菌大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)由本室保存。pMal-p2x：购自New England Biolabs Inc.
1.1.2
酶及试剂 限制性内切酶、T4连接酶、DL2000marker购自Takara公司和New England Biolabs，pfuE、TaqE购自上海生工公司。
1.1.3
主要仪器 Sigma 3K12 离心机、Beckman GS-15R 离心机、Sigma 112离心机、Perkin elmer DNA thermal cycler 480、Cole-Parmer instrument co. 超声破碎仪、Mettler AZ260 电子天平、TH288-1台式摇床、国产恒压恒流电泳仪DF-C、Bio-RAD垂直电泳仪、Bio-RAD水平电泳仪、国产Q/YS002-9恒温水箱
1.2
方法
1.2.1
引物设计
1.2.1.1
CAT基因的克隆 设计扩增CAT的两条上游引物P1、P3，其中P1包括一个Kpn I位点，一段柔性的linker编码序列及CAT的N端6个氨基酸编码序列。P3引入NdeⅠ位点。在Nde I和Kpn I之间插入了三个终止密码子（TAA、TAG、TGA）。一条下游引物P2包括一个Hind III点，Pst I位点及CAT C端的6个氨基酸编码序列，引物序列如下：
Kpn I linker
上游引物P1: 5’-GGG
GGT ACC GGT AGC GCG GGC AGT GCT GCG GGT TCT GGC GGT GTC GAC ATG GAG AAA-3’
NdeⅠ
上游引物P3：5’-ATA
CAT ATG GTG TAA CTG AGT AGG TAC –3’
Hind III Pst I
下游引物P2: 5’-CCC
AAG CTT GC
C TGC AGG TCG ACT CAT TAC GCC CCG CCC TGC CA –3’
1.2.1.2
IGF（Insulin-like growth fachor 胰岛素样生长因子）基因的克隆 在上游引物中除了IGF的前6个氨基酸的编码序列，还加入了Nde I酶切位点；下游引物则引入了Kpn I位点。
NdeI
P4上游引物：5’-AAA CAT ATG GGT CCA GAA ACT CTG TGT GG-3’
KpnI
P5下游引物：5’-GGG GGT ACC
AGC AGA TTT AGC CGG TTT CAG CGG-3’
1.2.1.3
白细胞介素3（IL-3）基因的克隆
在上下游引物中分别引入NdeⅠ和KpnⅠ酶切位点，便于IL-3的克隆。
NdeI
P6上游引物：5’- GGG AAT TCA TAT GAG CCG CCT GCC CGT CCT G –3’
KpnI
P7下游引物：5’-GGG GTA CCA AAT AGC GCG AGG CTC AAA GT-3’
1.2.1.4
硫氧还蛋白（TRx）基因的克隆
NdeI
P8上游引物：5’-GGG AAT TCA TAT GAG CGA TAA AAT TAT TCA C-3’
KpnI
P9下游引物：5’-GGG GTA CCC GCC AGG TTA GCG TCG AGG-3’
所有引物均有上海生工公司合成，使用前配成0.5umol/L浓度的工作液。
1.2.2
PCR扩增 95℃变性2分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸50秒；循环数35，72℃延伸5分钟。
1.2.3
