丙型肝炎病毒（HCV）是单股正链线状RNA病毒，其基因组的主要特点是高度多态性和变异性[1]，为病毒性肝病的重要病原。由于HCV的复制所依赖的多聚酶缺乏校对功能，加上为适应环境逃避宿主免疫监视作用而易发生突变，在长期的演化过程中产生了许多基因变异株。目前把HCV分为6个型和11个亚型[2]。我国HCV主要基因型为1b型,约占45%～75% [3,4]。临床研究显示，感染HCV-lb病毒的患者更易患肝硬化和肝癌[5]，且HCV-lb亚型的丙肝病毒对标准的α-干扰素用药剂量和周期是不敏感的，而必需使用高剂量并延长用药时间[6]；还有研究显示HCV-lb对β-干扰素敏感[7]。在HCV诊断方面，目前采用的免疫学方法以及PCR技术均存在一定的缺陷，基因芯片能够从基因水平对病原体进行诊断，具有高通量平行检测的特点，在早期诊断方面具有一定的优越性 [8]。我们利用cDNA文库法，制备HCV-1b探针，探索此方法制备芯片来进行HCV检测与分型的可行性。
1
材料与方法
1.1
探针模板 HCV-1b全长cDNA克隆pCV-J4L6S
[9]由美国国立卫生研究院(NIH)的Jens Bukh博士馈赠；
1.2
标本来源 广州军区总医院和南方医院门诊及住院确诊丙型肝炎患者静脉血，其中HCV-1b 5例,HCV-1a 1例，HCV-2a 1例，健康人5例；HCV RNA Real-time RT-PCR(Taqman法)检测试剂盒由深圳匹基生物工程公司提供，阳性血清中HCV RNA定量>5.0×10
3copies/ml，标本采集、处理、检测操作、结果分析严格按照说明书执行；受体菌XL-1由本室保存。
1.3
试剂 pMD18-T Vector、PCR试剂、dNTP、
Sau3AⅠ、
EcoR Ⅰ、
NotⅠ、
XbaⅠ、切胶回收试剂盒购自TaKaRa公司；质粒抽提试剂盒、纯化试剂盒购自上海博彩生物公司；Cy3 标记的通用引物(5’- GTTTGGCTGGTGTGGATCU-Cy3-3’)由Trilink公司合成；Poly-L-Lysine购自Sigma公司；硅烷化玻片片基购自DAKO公司；DMSO及Formamide购自Amresco公司；琥珀酸酐及1-甲基-2-吡咯烷酮购自Aldrich公司；硼酸钠购自Merk-Schuchardt公司；PixSys 5500基因芯片打印仪购自Cartesians公司；ScanArray Lite扫描仪购自GSI Lumoncis 公司；紫外交联仪购自BIO-RAD公司；杂交盒购自Corning公司；DU530紫外分光光度仪购自Beckman公司；真空干燥仪购自Savant公司。
1.4
制备HCV-1b诊断芯片探针
1.4.1
HCV-1b质粒pCV-J4L6S
EcoR Ⅰ酶切初步鉴定
0.2-0.5μg质粒于20μl酶切反应体系中，37℃水浴4h。取6μl酶切产物电泳。
1.4.2
从载体中切出HCV-1b全长cDNA，再用
Sau3AⅠ酶切 pCV-J4L6S用限制性内切酶
NotⅠ、
XbaⅠ作双酶切。2-3μg质粒于20μl反应体系中37℃ 4h。先取2-3μl电泳鉴定酶切完全后，将剩余的产物加到一个加样孔中。电泳结束后在紫外灯下用手术刀切下靶片段，用切胶回收试剂盒回收。再将回收片段用限制性内切酶
Sau3A I进行酶切反应，37℃水浴4h。
1.4.3
72℃补平加A
将酶切产物用乙醇沉淀后，用灭菌超纯水溶解，加普通PCR反应试剂混合物（含PCR Buffer、dNTP、
Taq酶、Mg
2＋等）95℃变性5min、72℃延伸2h，对酶切后形成的粘性末端进行补平，并利用大部分耐热性DNA聚合酶所具有的特性在酶切补平产物的3’末端添加一个A。
1.4.4
AT克隆
补平加A后的酶切产物乙醇沉淀后，用灭菌超纯水溶解，再与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌XL-1，涂平板，37℃培养过夜。挑取平板上的阳性克隆，接种于含0.5ml LB液体培养基及100mg/L氨苄青霉素的1.5ml Eppendorf管中，37℃培养5h。取100 ml菌液在沸水中裂解10min，离心沉淀菌体。取上清作模板，用pMD18-T载体引物（SO100 5′-CTAAAACGACGGCCAGT-3′，SO101 5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′）进行PCR初步鉴定。
1.5
芯片打印与固化
将纯化后PCR产物加DMSO调整浓度为500ng/μl。以植物 (水稻)、真核细胞(K562细胞)、细菌(大肠杆菌)基因片段为阴性对照，50%DMSO为空白对照，用Pixsys5500芯片打印仪在Corning玻片上打印阵列为12×14的点阵，从上至下，从左到右分别是：阳性对照打印12个点；接着分别是阴性对照（水稻、K562细胞、大肠杆菌基因片段）、空白各6个点；再接着是HCV-1b探针，每个探针打印6个点（Fig.1）。打印后的玻片BIO-RAD紫外线交联仪（能量为150mJ）,80℃干烤2h。避光放置备用。量为150mJ）,80℃干烤2h。避光放置备用。
740)this.width=740" border=undefined> 1.5.1
RD技术[10，11]标记样品
cDNA样品用Sau3AⅠ酶切后连接上接头（SIP：5′-pGATCmCACACCAGCCAAACCCA-3′及SIR:5′-GGTTTGGCTGGTGTG-3′），在EP管中加入5μl cDNA酶切反应液，3μl通用接头，2μl T4 DNA连接酶，3μl 10×buffer，17μl ddH2O，16℃保持2h，最后以Pharmacia S-400离心柱除去接头二聚体和小于100bp的小片段，收集洗脱液作为PCR标记的模板。加入25μl 2×PCR缓冲液，5μl dNTP（各2mmol/L），1μl模板，2μlCy3标记的通用引物U，加ddH2O至体积为49μl，最后加入1μl Taq DNA聚合酶。95℃，5min； 95℃，30s，60℃，30s，72℃，60s，25个循环；72℃，5min。 1.5.2
