Jo-1抗原是组氨酰-tRNA合成酶（HARS）基因的表达产物，与多发性肌炎/皮肌炎(ＰＭ/ＤＭ)的发病机理有关。应用RT-PCR技术,我们在国内首次克隆表达成功人自身抗原Jo-1，为下一步建立以多种基因重组自身抗原为配体的自身抗体金标快速检测方法奠定了基础。
1 材料与方法
1.1
质粒、菌株和细胞株 pMD18-T Vector购自TaKaRa公司；pGEX-5T，大肠杆菌JM109，BL-21，本室保存；人白血病淋巴细胞HL-60由福建省血液病研究所黄惠娟博士惠赠。
1.2
主要试剂和仪器 各种限制性内切酶，T4 DNA连接酶，Taq酶，PCR扩增试剂盒，DL2000 DNA标志物，均购自TaKaRa生物技术有限公司。引物由上海生工合成。3S Trizol总RNA抽提试剂盒，反转录系统，质粒抽提和胶回收试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司，标准蛋白分子量标志物，核糖核酸酶RNase A，氨苄青霉素，硝酸纤维素膜购自上海华舜生物工程有限公司。ＨＲＰ标记鼠抗人抗体(华美生物技术公司)。抗- Sm标准血清购自Sigma公司。PCR扩增仪:PE 2400型（ABI），SX-300 Image System四星凝胶成像系统:上海四星生物技术有限公司，超声仪、紫外分光光度计、蛋白半干电转移装置：Pharmacia。二氧化碳孵箱：美国产。
1.3
细胞培养 人白血病淋巴细胞HL-60在二氧化碳孵箱培养，收获（细胞数最大不超过1x107），离心，弃上清。
1.4
总RNA提取及重组鼠白血病毒逆转录酶（M-MuLV RT）第一链cDNA合成 按操作说明进行。
1.5
PCR扩增目的基因 我们在Genebank库检索到Jo-1基因的编码序列，分别在其两侧自行设计引物，并引入限制性酶切位 点，以利克隆之需。引物1为：5’-aag gga tcc atg gca gag cgt gcg gcg ctg gag-3’, 引物2为：5’-aag gtc gac tca gca gat gca gag ggg ctg gcc-3’（注： gga tcc为BamH I限制性酶切位点，gtc gac为Sal I限制性酶切位点）。PCR循环条件为：94℃预变性3分钟，94℃45秒65℃45秒72℃1分钟，循环30次，72℃延伸30分钟。取10ul 1.2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
1.6
PCR产物的回收、纯化、TA克隆及测序 转化子采用蓝白斑筛选，重组克隆在X-gal/ IPTG平板上呈白色，非重组克隆呈蓝色。挑取白色菌落至含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜。交上海生工公司用M13通用引物直接进行测序来确定是否含有目的克隆。
1.7
定向克隆 分别将上述鉴定好的TA克隆和含pGEX-5T GST融合表达载体的大肠杆菌增菌后抽提质粒，用合适的双酶切后，电泳回收所需片段，定向连接，重组质粒经ＣａＣｌ2法转导入宿主菌E.coli BL21，挑取转化子，酶切鉴定。
1.8
重组质粒在大肠杆菌的表达 将阳性转化子加入ＬＢ培养液，37℃振荡培养45ｍｉｎ后,均匀涂布于ＬＢ平板上(含氨苄青霉素100μｇ/ｍｌ), 37℃培养过夜,同时用E.coli BL21空菌和pGEX-5T转染菌分别作阴、阳性对照。从上述在ＬＢ/Ａｍｐ平板过夜培养生长的细菌克隆中挑选1个生长良好,直径约为2ｍｍ的菌落,接种于ＬＢ/Ａｍｐ培养液37℃振摇过夜, 次日1∶1000稀释转种于新的1ＬＬＢ/Ａｍｐ培养液中,37℃振摇培养约3ｈ(Ａ值约为0.5～0.6),然后加入ＩＰＴＧ至终浓度为1ｍｍｏｌ/Ｌ,诱导3ｈ。收集少量菌液,煮沸裂菌后离心取上清。
1.9
SDS-PAGE 取上述IPTG诱导菌上清20ul与2´上样缓冲液等体积混合后上样，同时取10ul对照上样，行SDS-PAGE电泳，考马斯亮兰R250染色。
1.10
Western blot 利用半干电转移仪将SDS-PAGE凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉为封闭试剂，一抗为自身抗原的标准血清，二抗为鼠抗人的辣根过氧化物酶复合物，在DAB、H2O2下显色。
2 结果
2.1
Jo-1基因的扩增 RT-PCR 结果电泳分析显示一条约1.5kb扩增条带，其大小与预计1526bp相符（图1）。
2.2
TA阳性克隆测序图谱 双向测序图谱与Genebank报道的完全一致（图略）。
2.3
pGEX-5T- Jo-1重组阳性克隆质粒的酶切分析 经BamH I和 Sal I酶切后，得到约5000bp和1526bp两条片段，与预期结果一致（图2）。
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2.4
融合蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析 本实验表达pGEX-5T- Jo-1融合蛋白，结果显示重组质粒诱导表达了一条约80KD的仅能被抗Jo-1标准血清识别的特异性蛋白条带（图3）。
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3 讨论
自身免疫病是一大类以产生各种各样的自身抗体为特征的全身或局部性疾病，其较高的发病率和严重的危害程度越来越受到医学界的关注，由于不同的自身免疫病具有不同的自身抗体谱，因此自身抗体的检测对于自身免疫病的研究、诊断和治疗具有重要的意义。
目前临床检测ＰＭ/ＤＭ的方法主要是蛋白免疫印迹法（IBT），由于IBT法所采用的未经纯化的兔胸腺抗原中有不同的蛋白质,虽然这些蛋白质分子量不同,但由于其带电荷不同,在电场中泳动速度仍可相同,从而使不同分子量的蛋白质出现电泳距离一致的条带。因此分子量相同的条带并不一定显示为抗某种单一蛋白的抗体。另一方面,IBT法中的抗原是经过变性的,即使有些抗体可能识别转移膜上的变性抗原决定簇,但并非所有抗体均能与变性抗原决定簇反应,在实际操作中经常出现这样或那样的问题。例如:标准带不显色、区带不显色或不清晰、非特异性的区带太多致结果不好报等等,这样易造成临床的误诊和漏诊[1，2]。
研究表明，在多发性肌炎(ＰＭ)的致病机理中，Jo-1可能特异性地介入天然和获得性免疫反应，促进抗原提呈细胞（APCs）和T细胞的增殖，导致免疫耐受性的解除，引发以CD4+ T细胞介导为主的自身免疫性肌细胞炎症[3，4]。抗Jo-1是多发性肌炎/皮肌炎(ＰＭ/ＤＭ)的特异性标志性抗体，在ＰＭ/ＤＭ中的检出率很高（78.5%），与抗U1RNP 70KD,抗SS-A和抗SS-B相比，它的特异性最好[5]。由pGEX-5T构建的GST和目的基因的融合体，有利于蛋白质的稳定表达和纯化，而采用高纯度的基因重组自身抗原可望减少上述情况的发生，为临床提供更为敏感、特异、快速且可同时检测多种自身抗体的新方法。
