医学检验信息网 检验医学 2007-1-29 12:35:27

近期研究发现，人组织型激肽释放酶基因家族（Kallikrein，KLK）编码一组具有丝氨酸蛋白酶活性的组织型激肽释放酶（Human Kallikrein，hK），KLK基因家族由15个成员组成，在基因和蛋白质的结构上是高度保守的。KLK在多种正常组织中表达，在多种肿瘤组织中KLK高表达，有望成为有价值的肿瘤标志物^[1]。KLK6是KLK成员之一，其编码蛋白被命名为hK6^[2]。曾有人用差异显示技术发现其卵巢癌和乳腺癌组织差异表达^[3]，用组化的方法发现hK6在卵巢癌组织表达增高^[4]，用SAGE和EST数据库分析认为在乳腺癌组织中KLK6表达降低^[5]。迄今为止，尚无用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（FQ-PCR）方法分析KLK6 mRNA表达水平的报道。本研究利用SYBR Green I染料建立了检测KLK6 mRNA表达水平的FQ-PCR方法，以从mRNA转录水平分析KLK6基因的表达，以便用于进行其与乳腺癌的关联性的探讨。

1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 标本来源 正常乳腺（15份）和原位乳腺癌(17份)组织由济南军区总医院，山东省肿瘤医院和齐鲁医院普外科提供，病人年龄43～65岁，均被病理诊断证实。正常组织取自同一病人肿瘤组织5cm外，手术后立即放入10倍体积的RNALater中，4⁰C过夜后，转存入-70⁰C冰箱保存备用。 1.1.2 主要仪器与试剂 Trizol（Invitrogen），AMV逆转录酶、Ex Taq Kit和Real Time RT-PCR Core Kit 的PCR试剂（大连TaKaRa生物工程公司），pGEM-T easy与JM109（美国Promega公司），10000×SYBR Green I（美国Amresco），DNA Marker、RNALater（天为时代公司），Bioer XP cyclerPCR仪，LineGene FQD-33A荧光定量PCR仪（杭州博日公司）。 1.1.3 引物设计和合成 根据基因库中KLK6序列(mRNA:D78203)，利用软件Primer Premier 5.0设计特异引物，并使上下游引物跨越1个内含子，以避免基因组的污染影响结果。GAPDH引物参考文献^[6] 设计，均由大连TaKaRa公司合成。KLK6：上游引物5’-TTC CTG CCA GGG TGA TTCT-3’，下游引物5’-CAC TTG GCC TGA ATG GTT TT-3`，片段长度162bp。GAPDH：上游引物5`-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3`，下游引物5`GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3`，片段长度220bp。 1.2 方法 1.2.1 模板RNA提取 组织总RNA提取按说明书操作；通过0.7%甲醛琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分析RNA质量和浓度。 1.2.2 逆转录反应 取正常或乳腺癌组织总RNA 2μg，20μl反应体系中包括：MgCl₂ 5mmol/L，dNTP 1mmol/L，RNase inhibitor16U，AMV RTase XL 2U，Oligo dT Primer 20pmol。反应条件为：30℃10min，42℃30min，95℃10min，5℃5min。 1.2.3 PCR及其产物的克隆测序 PCR反应体系包括：MgCl₂1.5mmol/L，dNTP0.2mmol/L，cDNA 1μl，上下游引物各10pmol，TaKaRa Ex Taq 0.5U。反应条件：94℃10 min，94℃30s，56℃30s，72℃30s，40个循环；72℃延伸2 min。PCR产物纯化采用乙醇沉淀法，连接与转化按说明书操作。PCR筛选阳性克隆，阳性克隆送交上海博亚生物技术有限公司测序。 1.2.4 FQ-PCR 20μl体系包括：TaKaRa 2×Real time Master Mix，40×SYBR 0.5μl，500 nmol/L KLK6或GAPDH引物，cDNA 1μl。反应条件为95℃5min变性，95℃10s, 56℃10s，72℃30s， 84℃0s, 40个循环，84℃单次检测荧光。扩增完毕后，进行熔解曲线分析，94⁰C 1min, 61⁰C 1min, 72℃ 1min，以0.1⁰C /s的速度升温到92⁰C，连续监测荧光。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析特异性。采用样点拟合法分析结果得到标本中KLK6和GAPDH的Ct值。 1.2.5 重复性检测 随机抽取2份标本，各重复5管，以估计批内变异系数（CV）。在不同时间对1份标本重复4次，以估计批间变异系数（CV）。 1.2.6 扩增效率的计算 取1份cDNA进行序列稀释后(100，20，4和0.8ng)进行扩增。以Ct值对浓度的对数作图，得到斜率S，用公式：E=10^-1/S-1分别计算KLK6和GAPDH的扩增效率（E_K和E_G）。 (1+E_G)^Ctg KLK6/GAPDH比值= (1+E_K)^Ctk 1.2.7

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