先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)是一类严重危害婴幼儿健康的先天畸形，活产儿中的发病率为0.8%～1%，在流产儿和死胎中则高达10%[1]。其中约有80%仅表现为心脏畸形，而不伴有其它系统的先天异常，称之为单纯性先天性心脏病(simple congenital heart disease)。临床资料和流行病学研究表明，作为一种复杂性疾病，CHD主要是由于胚胎期遗传因素和环境因素共同作用，从而导致心血管系统发育异常。遗传因素在CHD的发病过程中发挥重要作用，遗传率为55%～65%，但其遗传方式、外显率等均不清楚，易感基因尚未确定［2］。所以，研究CHD的分子遗传学机制，不仅可为阐明CHD的发生机制和遗传学干预提供理论依据，而且可以为其它先天畸形的研究提供可借鉴的科学方法。
我室前期研究曾对61个单纯性CHD核心家系进行传递不平衡检验，将人类单纯性CHD易感区域定位于12q13.1～13.3区域3.4cM。在此易感区域内存在一个重要的发育相关基因～HoxC簇基因。Hox基因是控制脊椎动物胚胎发育及器官形成的主要基因，其功能的改变可直接影响发育。我们选择HoxC4、HoxC5、HoxC6基因区域内4个已知单核苷酸多态（single nucleotide polymorphism,SNP）位点：rs894737、rs2277371、rs2071450 、rs2071448，应用限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、变性高效液相色谱（denatured high-performance liquid chromatography, DHPLC）结合测序，检测其在108例单纯性CHD患者及200名正常人中的分布情况。分析其与单纯性CHD的相关性并做单倍型分析，为寻找单纯性CHD易感基因奠定基础。
１ 对象与方法
1.1
研究对象 108例单纯性CHD患者（年龄2～19岁）静脉血，标本由中国医科大学第一、第二临床医院和沈阳军区总医院提供。所有患者均具有典型的临床症状，经彩超和手术确诊；200名正常健康人(年龄12～57岁)静脉血，标本来自中国医科大学第一临床医院门诊体检。研究对象均来自东北地区。
1.2
方法
1.2.1
SNP的选取及引物设计 HoxC4基因区域覆盖了另两个HoxC簇基因－HoxC5
、HoxC6。在此区域内选择4个已知SNP位点，明确两侧基因组序列及SNP是否引起酶切位点改变。应用Primer3软件设计引物（Sangon公司合成）。其多态类型、相对位置、引物序列、扩增片段长度及酶切后片段长度见表1；4个SNP及HoxC4、HoxC5、HoxC6基因相对位置见图1。
表1
4个SNP位点多态类型、相对位置、引物序列、扩增片段长度及酶切后片段长度
Table 1
Polymorphism, location,primer sequence, length of PCR and length after enzyme digest of 4 SNPs
| SNP ID (SNP编号) | Location (位置 )*
| Primersequence (引物序列) | Length (长度) | Length after enzyme digest (MspI 酶切后片段长度) |
| rs894737
| G7471T(HoxC4) G7308T(HoxC6) | TACTGTGAGTGGGTGGCAGA/ AGCTGGACCAGGCAGGTAG | 583bp | 360bp/223bp |
| rs2071448 | C16476T(HoxC4) C316T(HoxC5) | CATGTGCAGTTTGGTCATCC/ GCGGATTGGACTTAAGCATC | 326bp | - |
| rs2071450 | A17860G(HoxC4) A1701G(HoxC5) | AGGAGAGGGCGAGGTTAGAG/ CTACCGACCCAGGGTTCC | 254bp | - |
| rs2277371 | A36130G(HoxC4) | TACTGTGAGTGGGTGGCAGA/ GTCATTTCTGGAGGTCTGGG | 537bp | 360bp/177bp |
