肾上腺脑白质营养不良（adrenoleukodystrophy，ALD）是一种主要侵犯大脑白质、肾上腺等器官的X-连锁隐性遗传病，其主要特征是极长链饱和脂肪酸（very long chain fatty acids，VLCFA）在体内大量堆积，引起大脑白质脱髓鞘改变、肾上腺功能不全等病理改变。ALD的致病基因称为ALD基因，定位于染色体Xq28，编码ALD蛋白（ALD protein，ALDP）。ALDP属于ATP结合盒（ATP-binding cassette，ABC）转运蛋白超家族D亚家族，且其排序为第一位，故ALDP又称为ABCD1蛋白，ALD基因称为ABCD1基因。ALD的病程呈进行性发展，预后不良，尤以儿童大脑型为甚，发病后的平均生存时间仅为3年左右[1]。分子诊断作为ALD诊断的重要手段，通过RT-PCR、限制性酶切分析、PCR产物直接测序等方法和技术，能准确查出ALD患者的基因突变类型和位点。最近，我院接诊了1个ALD家系，为其进行基因突变分析，现报告如下。
1 材料与方法
1.1
研究对象 患者，陈某，男，11岁，汉族，浙江乐清市人。2年前出现视物不清、学习成绩下降、反应迟钝等临床症状，此后呈进行性加重。曾就诊于上海市华山医院，头颅MRI显示，双侧枕叶、侧脑室、三角区周围见片状异常信号影，双侧对称性分布，并沿胼胝体压部延伸呈蝶形，纵向沿纤维白质往下到脑干中脑，诊断为儿童大脑型ALD（CCALD）。患者二哥2年前因患ALD（上海华山医院诊断）死亡，患者父母体健，非近亲婚配。患者大哥现上中学，未出现类似症状。
1.2
长链RT-PCR和直接测序 采集ALD家系所有成员和无关对照的外周血，用QIAamp
@ blood RNA mini kit提取全血总RNA，并反转录成cDNA。参照文献[2]，先扩增
ABCD1基因cDNA编码区全长，然后分4段（ALD1、ALD2、ALD3、ALD4）对
ABCD1基因cDNA编码区进行扩增，其中每个片段的
3’端和下一个片段的
5’端部分重叠。在总反应体积50 μl中：cDNA 2 μl、引物各为30 pmol、dNTP 0.2 mmol/L、
Taq DNA聚合酶5 U。反应条件：
94℃ 2 min；
94℃ 45 s，
56℃ 30 s，
72℃ 60 s，30个循环；
72℃ 5 min。4对引物的退火温度分别为
56℃、
58℃、
55℃、
55℃。PCR产物纯化后，以相应引物，委托上海博亚公司用末端终止法，在ABI 3730型DNA测序仪进行序列分析。
1.3
基因组DNA扩增和限制性内切酶分析 患者及其家系成员的外周血基因组DNA，按试剂盒（MoBio DNA Blood Isolation Kit）说明提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，扩增
ABCD1基因突变所在的局部区域（外显子2）。采用Primer 3.0软件设计PCR引物，其上游引物（PE2
-84F）：
5’-ACTGGGAGACCC TGACCATC
-3’，下游引物（PIV2163R）：
5’-CGAGCTCAACCTCTGAAAGC
-3’。预期扩增片段大小为428 bp。PCR反应条件：
94℃ 4 min；
94℃ 30 s，
55℃ 30 s，
72℃ 45 s，30个循环；
72℃ 5 min。PCR产物纯化后，根据突变的性质，采用
Eco47Ⅰ对PCR产物进行酶切分析，于
25 g/L琼脂糖上电泳，并在Flour-S凝胶成像仪上成像。
2 结果
