流行性脑脊髓膜炎诊断标准及处理原则GB 16884—1997
前 言
流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)是由脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis，Nm)通过呼吸道传播所引起的化脓性脑膜炎，常在冬春季节引起发病与流行，患者以儿童为多见，流行时成年人发病亦增多。人受Nm感染后大多数表现为鼻咽部带菌状态，只有少数成为流脑患者，其主要临床表现为突发性高热、头痛、呕吐、皮肤和粘膜出血点或瘀斑及颈项强直等脑膜刺激征，脑脊液呈化脓性改变。此外，Nm也可不侵犯脑脊髓膜，仅表现为败血症，病重者可呈暴发型发作。
为了贯彻执行《中华人民共和国传染病防治法》，认真做好流脑流行病学监测与控制的工作，预防此病发病大幅度回升，控制其流行，特制定本标准。
本标准的附录A和B为标准的附录；附录C、D、E和F皆为提示的附录。
本标准由中华人民共和国卫生部提出。
本标准负责起草单位：中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所；参加起草单位：北京佑安医院和北京市卫生防疫站。
本标准主要起草人：胡绪敬、徐莲芝、吴贵坤。
本标准委托技术归口单位卫生部传染病防治监督管理办公室负责解释。
1 范围
本标准规定了流脑的诊断标准和处理原则。
本标准适用于各级、各类医疗保健、卫生防疫机构和人员对流脑病例诊断、报告与处理。
2 诊断原则
2.1 应根据流行病学资料和临床表现及实验室检验结果做出临床诊断。
2.2 确诊需要培养Nm或检测Nm群特异多糖抗原或Nm的DNA特异片段或检测病人急性期和恢复期血清中抗Nm特异抗体。
3 诊断标准
3.1 流行病学史
在冬春季节和流行地区内，儿童患病者最为多见。有些患者在发病前7天有明显密切接触史。
3.2 临床表现
3.2.1 突然寒战、高热、恶心、呕吐、流涕、鼻塞、咽痛、全身疼痛、头痛加重。
3.2.2 面色苍白、四肢发凉、皮肤发花并有散在的小出血点、唇周及指端青紫、唇周单纯疱疹。
3.2.3 烦躁不安、谵妄、昏迷或惊厥。
3.2.4 皮肤、粘膜瘀点典型或融合成瘀斑，血压明显下降、脉搏细速、脉压差缩小。
3.2.5 颈项强直、角弓反张、克氏征和布氏征阳性。
3.2.6 瞳孔大小不等、边缘不整、对光反应迟钝、眼球常凝视。
3.2.7 呼吸快慢及深浅不均或呼吸暂停。
3.2.8 幼儿发病多不典型，常见高热、呕吐、嗜睡外，还多见极度不安与惊厥、拒乳、尖叫、腹泻、咳嗽、双目凝视、颈项强直和布氏征阳性，其他脑膜刺激征可能缺项。前囟未闭者多见隆起，呕吐频繁而失水者也可出现囟门下陷。
3.3 实验室诊断
3.3.1 血象：白细胞数显著增高，最高可达40×10(上标始)9(上标终)/L，中性粒细胞在80％～90％以上。
3.3.2 疑为流脑者应做腰椎穿刺检查，脑脊液(CSF)压力常增高达1.96kPa以上；典型病例CSF的外观混浊如米汤样甚或脓样；白细胞数增多，可达每升数亿，以多形核细胞为主；蛋白质显著增高，可达1～5g/L；糖量常低于2.22mmol/L，氯化物也稍降低。CSF涂片可在中性粒细胞内找到革兰氏阴性双球菌。
3.3.3 从病人CSF或急性期血液分离到Nm，见附录A(标准的附录)。
3.3.4 从病人急性期血清或尿或CSF中检测到Nm群特异性多糖抗原，见附录C(标准的附录)。
3.3.5 检测病人恢复期血清抗体效价较急性期呈4倍或4倍以上升高，见附录B(标准的附录)。
3.3.6 以PCR检测到病人急性期血清或CSF中Nm的DNA特异片段，见附录D(提示的附录)。
3.4 病例分类
3.4.1 疑似病例：3.1加3.2.1或3.2.2或3.2.3之一项。
3.4.2 临床确诊病例：疑似病例加3.2.4或3.2.5或3.2.6或3.2.7之一项。
3.4.3 确诊病例：疑似病例或临床确诊病例加3.3.3或3.3.4或3.3.5或3.3.6之一项。
4 处理原则
4.1 对病人早期处理，见附录E(提示的附录)。
4.1.1 发现疫情及时向卫生防疫部门报告。
4.1.2 就地隔离，抢救治疗，降低病死率。
4.1.3 给予抗菌药物，及时控制感染。
4.1.4 早期发现并及时纠正休克与弥漫性血管内凝血(DIC)。
4.1.5 若早期发现颅内压增高症状，及时应用脱水疗法防治脑疝和呼吸衰竭。
4.2 对易感人群的处理，见附录F(提示的附录)。
4.2.1 与患者密切接触的人群出现上呼吸道感染样病人，应按轻症流脑患者处理。
4.2.2 根据流行病学监测结果，制定A群脑膜炎双球菌多糖菌苗预防注射的计划，在流行前期完成接种任务，免疫对象接种率应达到90％以上。
4.2.3 除了完成上述菌苗常规免疫任务以外，还应备有应急接种用的A群脑膜炎双球菌多糖菌苗，用于控制流脑暴发流行。
4.2.4 在未免疫地区出现A群Nm引起流脑暴发流行时，除了对15岁以下儿童，还应酌情对与病人密切接触的成人应急接种上述菌苗。
4.2.5 目前在我国，若出现非A群Nm引起流脑局部暴发，应及时对病人全家以及与其毗连的邻居实 施抗菌药物预防。
附录A
(标准的附录)
流脑病原学诊断方法
A1 病原体(脑膜炎奈瑟氏菌Neissria meningitidis)分离
从疑似流脑患者采集CSF或急性期血液分离Nm。
A1.1 标本的采集
A1.1.1 CSF：无菌操作，吸出CSF 2mL，立即放到无菌试管内离心(2000～3000r/min，30min)，用灭菌过的毛细管吸取沉淀物直接接种到10％羊血巧克力色琼脂上(CSF上清液部分供检测Nm特异抗原，亦可将其置于－20℃待测)，5％二氧化碳环境37℃培养24～72h，每日检查细菌生长的情况，及时分离纯培养物供鉴定。
A1.1.2 血液：采取病人急性期静脉血液6mL，无菌操作往盛有30mL增菌用的葡萄糖肉汤三角瓶内注入4mL血液(余下的2mL血液同上离心后吸出血清，供检测Nm特异抗原和抗体，亦可将其置于一20℃待测)，同上述条件培养24～72h，每日进行分离培养。
A1.2 接种和菌种鉴定
A1.2.1 细菌形态：Nm应为革兰氏阴性，呈卵圆形或肾形，0.8μm×0.6μm大小。常成对排列，临近两边扁平凹陷。
A1.2.2 菌落：Nm接种于巧克力色琼脂平皿上，5％二氧化碳，37℃培养24h后，其菌落直径约1mm，表面突起、光滑、湿润、圆整、略带灰白色、半透明、不溶血、无色素。培养时间延长，菌落增大、变成黄色、不透明，并可出现颗粒状中心和放射性周边。
A1.2.3 生长及抗原特性：绝大多数Nm菌株分解葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气。不分解蔗糖、果糖和乳糖。过氧化酶和氧化酶阳性。
Nm新分离菌株具有下列主要抗原：血清群特异性荚膜多糖，主要外膜蛋白－OMP(包括血清型特异的2/3类OMP，亚型特异的1类OMP以及4与5类OMP)，铁调节蛋白，脂寡糖(LOS)，H.8脂蛋白，还有菌毛抗原等，根据群特异性荚膜多糖的结构与组成成分，Nm可分为13个血清群(A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W135、X、Y、Z)，其中90％以上的病例是由A、B和C群Nm引起的。根据2/3类OMP可将B群与C群Nm分成20个血清型，但差不多半数菌株目前尚不能分型。在可分型菌株中，以15、2和4型，P1.2、P1.1、P1.12、P1.15及P1.16亚型多见；对于A群Nm现有4与21两个血清型，以P1.7与P1.9亚型多见。Nm还可以分成13个LOS免疫型，其中A群以L10和L11型多见，B群中以L3，7，9复合型多见。Nm群特异性荚膜多糖、型和亚型的OMP及LOS等抗原成分对流脑发病与流行及其菌苗的研究均具有重要价值。
附录B
(标准的附录)
流脑血清学诊断方法
B1 玻片凝集试验
B1.1 目的
应用玻片凝集试验对Nm病原菌株或带菌者菌株进行血清学分群。
B1.2 材料
B1.2.1 待检的Nm菌株纯培养物。
B1.2.2 Nm诊断血清：多价I(包含A、B、C、D群)，多价Ⅱ〔包含1889(Y)、1890(H)、1892(29E)］，多价Ⅲ［包含319(W135)、1916(X)、1486(I)、1811(K)群］及各群单价血清，共计14种。
B1.2.3 洁净载玻片。
B1.2.4 生理盐水。
B1.3 试验方法
B1.3.1 先将诊断血清按说明书稀释成所需的浓度，滴一滴在洁净的玻片上。
B1.3.2 用白金耳刮取菌苔少许，在玻片上沾取少量血清，在一旁研磨均匀，再与血清混匀。
B1.3.3 轻轻摇动玻片数次，在1～2min内出现明显凝集者，即为阳性。
B1.3.4 检查从病人分离的疑似Nm时，先试A群血清，若不与其发生凝集，则试用B或C群血清，仍不凝集时，则试用多价Ⅱ或多价Ⅲ血清。若发生凝集，再用单价血清定群。从病人分离的疑似Nm对现有诊断血清皆不凝集者则送研究单位进一步鉴定。
B1.3.5 在玻片上与各群诊断血清、盐水或正常兔血清皆发生凝集者，即定为自凝菌。
B2 酶联免疫吸附试验(ELISA)
B2.1 目的应用ELISA间接法测病人急性期和恢复期血清中的抗体水平。此方法也可以应用于健康者血清抗体的测定。
B2.2 材料
B2.2.1 酶联免疫吸附试验检测仪。
B2.2.2 聚苯乙烯板(40孔或96孔)。
B2.2.3 加样器(单头或4头或8头，定量为0～200μL)。
B2.2.4 羊抗人IgG辣根过氧化酶结合物。
B2.2.5 试验质控血清(抗体阳性和阴性的人血清)。
B2.2.6 菌体抗原(A、B和C群Nm标准菌株)或A群Nm多糖菌苗。
B2.2.7 包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液)：
碳酸氢钠(NaHCO(下标始)3(下标终)) 2.9g
碳酸钠(Na(下标始)2(下标终)CO(下标始)3(下标终)) 1.6g
叠氮钠(NaN(下标始)3(下标终)) 0.2g
加蒸馏水至1000mL，pH9.6，置4℃可备用两周。
B2.2.8 洗涤液(0.5mol/L氯化钠)：
氯化钠(NaCl) 29.3g
吐温－20(Tween－20) 0.5mL
加蒸馏水至1000mL，临用前配制。
B2.2.9 稀释液：
氯化钠(NaCl) 8.0g
磷酸二氢钾(KH(下标始)2(下标终)PO(下标始)4(下标终)) 0.2g
磷酸氢二钠(Na(下标始)2(下标终)HPO(下标始)4(下标终)·12H(下标始)2(下标终)O) 2.9g
氯化钾(KCl) 0.2g
吐温－20(Tween－20) 0.5mL
加蒸馏水至1000mL，pH7.4，置4℃备用。
B2.2.10 底物缓冲液：
(1)0.2mo1/L磷酸氢二钠
磷酸氢二钠(Na(下标始)2(下标终)HPO(下标始)4(下标终)·12H(下标始)2(下标终)O) 35.8g
蒸馏水 500mL
(2)0.1mol/L柠檬酸
柠檬酸〔C(下标始)3(下标终)H(下标始)4(下标终)(OH)(COOH)(下标始)3(下标终)·H(下标始)2(下标终)O］ 10.5g
蒸馏水 500mL
(1)液和(2)液分别置4℃备用。
临用前按下述配方配制底物溶液，pH为5.0：
(1)液 2.57mL
(2)液 2.43mL
邻苯二胺 4mg
蒸馏水 5mL
30％H(下标始)2(下标终)O(下标始)2(下标终) 15μL
B2.2.11 填充液：
稀释液 100mL
白明胶或牛血清白蛋白(Bovine Serium Albumin，BSA) 0.5g
B2.2.12 终止溶液：2mo1/L硫酸(H(下标始)2(下标终)SO(下标始)4(下标终))。
B2.3 试验步骤
B2.3.1 包被抗原的制备
将Nm纯培养的菌苔刮到生理盐水中，离心(3000r/min，30min)洗涤菌体3次，再混悬于生理盐水中，置56℃30min灭活，用比浊法测定菌悬液中细菌浓度，用包被液将其稀释成10(上标始)6(上标终)个菌/mL作为包被抗原。对于A群Nm，亦可将A群Nm多糖菌苗稀释到10μg/mL进行包被。
B2.3.2 抗原的包被
用蒸馏水把酶标板各孔冲洗干净，空干水，置37℃烘干；往每孔中加包被抗原100μL，置4C过夜；倾出孔内液体，用洗涤液冲洗各孔3次，每次1min，并且均在干净的吸水纸上或纱布上拍打酶标板，空干孔内的液体。
B2.3.3 填充
空干孔中液体，用1mL吸管加填充液，每孔加以0.25mL；置室温30min，同上洗涤，空干孔内液体；酶标板置塑料袋中，密封贮存于4C，可备用一个月。
B2.3.4 检测待检血清
B2.3.4.1 病人急性期和恢复期血清均从此1∶2开始，用稀释液连续倍比稀释到第7孔，第8孔以稀释液代替血清作为阴性对照之一；酶标板置37℃培育1h后同上洗涤。
B2.3.4.2 加酶结合物
上述酶结合物用稀释液稀释到预试测定的最适工作浓度，每孔加100μL，置37C反应1h后同上洗涤酶标板。
B2.3.4.3 每孔加B2.2.10中配制的底物溶液100μL，置37℃反应15min。
B2.3.4.4 终止反应
每孔加2mol/L硫酸(H(下标始)2(下标终)SO(下标始)4(下标终))50μL。
B2.3.4.5 测光密度值
在495nm波长下测定每孔的光密度值，并记录。
B2.3.4.6 每次实验设置下列对照：
阳性和阴性血清质控对照；抗原对照(以稀释液代替待检血清，其余同试验组)；缓冲液对照(以包被液和稀释液代替抗原和待检血清，其余同试验组)。
B2.3.4.7 结果判定
若被检孔的光密度值与平行对照孔的光密度值比值(P/N)≥2，即判断为阳性反应。
B3 杀菌力试验
B3.1 目的
应用微量杀菌力试验(TTC法)测定病人急性期和恢复期血清中对Nm的杀菌抗体水平。此方法也可用于健康人群的血清抗体测定。
B3.2 材料
B3.2.1 靶菌：对补体的自然杀菌作用具有耐受性，但对杀菌抗体反应敏感的Nm(A群29019，B群和C群Nm)。
B3.2.2 稀释液：Dulbeccos磷酸盐缓冲盐水
A液：氯化钠(NaCl)8.0g，氯化钾(KCl)0.2g，磷酸氢二钠(Na(下标始)2(下标终)HPO(下标始)4(下标终))1.15g，磷酸二氢钾(KH(下标始)2(下标终)PO(下标始)4(下标终))0.2g，蒸馏水800mL；
B液：氯化钙(CaCl(下标始)2(下标终))0.1g，蒸馏水100mL；
C液：氯化镁(MgCl(下标始)2(下标终)·6H(下标始)2(下标终)O)0.1g，蒸馏水100mL。
上述三液分别灭菌121℃，15min，置4℃备用。需用时按A液8份，B液和C液各1份的比例混合，pH为7.1。
使用时每100mL稀释液加灭活小兔血清1mL，万古霉素500μg，多粘菌素B2500单位或硫酸抗敌霉素5000单位。配就的稀释液盛于小瓶中，置4℃备用2周。
B3.2.3 滴定板：底部呈“U”形的96孔有机玻璃微滴板，并备用同样大小的普通玻璃作盖板。将它们平放在80℃的烤箱内烤2h后备用。试验完毕，以约80℃的热水泡板1h杀死靶菌，再以自来水冲洗干净，并用棉棒拭净不洁净的孔。最后以蒸馏水冲洗一次，37℃烤干后同上于80℃干烤。
滴定板使用一段时间后或遇到杂菌污染较严重时，可用热水杀死靶菌并冲洗干净；在比较稀的硫酸重铬酸钾清洁液内浸泡4h，冲洗干净后同上处理备用。
B3.2.4 兔补体
B3.2.4.1 补体可从幼龄兔或成龄兔血清中筛选，预试测定要求它们既不能具有自然杀靶菌的活性，但加有已知阳性参考血清时应产生较高杀菌抗体滴度。不过，幼龄兔被选中的机率较高。
B3.2.4.2 将所选家兔从颈动脉放血或抽取全部心血，置4℃，待血液凝固后尽早分离血清，混合后，分装到2mL安瓿中，每只放1mL血清。立即将安瓿置—20℃以下冰箱内冷冻过夜，次日进行冷冻干燥。冻干以后再抽样检查时，不应出现非特异杀菌反应，特异杀菌抗体滴度在1：3200以上则保存在—20℃以下冰箱内，可备用3～6个月。为减少补体批次间的差异，可将所选定的兔血清混合后进行冷冻干燥，再作质量检定，合格者则保存于—20℃以下。
B3.2.5 氯化三苯四氮唑(Triphenyl Tetrazolium Chloride，TTC)琼脂培养基(TTC琼脂)
B3.2.5.1 TTC琼脂配方：
牛肉膏0.5％，氯化钠0.5％，日本多胨3.0％，可溶性淀粉0.2％，以蒸馏水配制，调pH7.4～7.6，琼脂0.5％。
B3.2.5.2 TTC琼脂制作
上述培养基成分熔化后，按每10mL或20mL分装于大试管，121℃灭菌15min，冷却后置4℃备用。临用前将培养基加热熔化，每10mL培养基加50％葡萄糖注射液0.1mL，1％TTC水溶液(4℃避光保存)0.1mL，混匀放在45℃水溶液中待用。
B3.2.5.3 阳性参考血清
用Nm免疫兔制备的诊断血清，未加防腐剂，经预试测定其杀菌抗体滴度较高(1∶3200以上)。
B3.2.5.4 滴管与滴头
采用临床上输液用的玻璃输液接头作滴管，滴头采用12号输液针，在砂轮上磨去针头的斜面部分，使其下口呈圆形。用滴管与滴头滴稀释液应是40滴/mL±2滴/mL。它们可用于滴加稀释液、补体、靶菌液、TTC琼脂及待检血清。如有条件，血清最好用25μL移液器稀释。
B3.3 杀菌抗体测定步骤
B3.3.1 靶菌液的制备
B3.3.1.1 开启A、B或C群Nm菌种，接种到巧克力色琼脂平皿上，37℃二氧化碳孵箱或烛缸培养15～20h，挑取3～5个菌落涂于另一平皿，同上培养10～15h。
B3.3.1.2 用Nm诊断血清和生理盐水进行玻片凝集及显微镜检查，以核实菌种。
B3.3.1.3 菌种被确证以后，取其菌苔，混匀于2mL灭菌脱脂牛奶管中，制成浓菌液，分装若干支小试管，每管约0.2mL，置—20℃以下保存，Nm可存活3～6个月。
B3.3.1.4 需用靶菌时，取出一支上述牛奶菌种管，熔化后立即转种并放在4℃冰箱内保存，供每日分离靶菌制作菌悬液，可备用2周。在测定抗体的过程中，每次所用靶菌传种的代数保持一致。
B3.3.1.5 从所分离的靶菌平皿上挑取3～5个典型菌落，涂抹转种1/4巧克力色琼脂平皿，37℃烛缸培养4～6h，刮取菌苔，于盛有3.5mL左右稀释液的试管壁上用白金耳将其充分研磨，制成轻度混浊的均匀菌悬液，其光密度值相当于0.1。
B3.3.1.6 取出上述菌悬液2mL加到0.5cm的比色杯内，在波长为540nm的分光光度计上测其光密度值。
B3.3.1.7 稀释液用量按式(B1)计算：
X＝OD×10—0.1……………………………(B1)
式中：X——稀释液用量，mL；
OD——光密度值。
按照式(B1)计算稀释液用量，然后往里加入0.1mL靶菌悬液，此时相当于光密度值为0.1的靶菌液作了10倍稀释。吹吸均匀后，由其开始再连续作10倍稀释至10(上标始)－5(上标终)稀释度，以菌液的最终浓度为每毫升含4000个菌落形成单位为宜。稀释时每个稀释度更换一个移液枪头。
B3.3.1.8 稀释好的靶菌悬液在1h内用完。若室温较高，可将菌液管置冰浴中，以防靶菌迅速死亡。
B3.3.2 杀菌抗体的测定
B3.3.2.1 先在微滴板每孔内加1滴相当于25μL的稀释液。
B3.3.2.2 用移液器从每排第一孔内加25μL经56℃30min灭活的待检血清，吹吸5～10次后吸出25μL至下一孔，如此作连续倍比稀释至最后一孔。每份血清分别用一支移液枪头。
B3.3.2.3 从低温冰箱内取出补体，于37℃温水中摇动将其速溶，每孔加一滴。若补体已冷冻干燥，可往安瓿内加相当于补体血清原体积的稀释液，使其融化后即刻使用。
B3.3.2.4 每孔加一滴稀释成合适浓度的靶菌菌液，微滴板置微型振荡器上中速振荡5min，再在37℃培养25min，取出后重复上述振荡。
B3.3.2.5 每孔加2滴已熔化冷至45℃左右的TTC琼脂后，微滴板置37℃烛缸内培养15～20h后观察结果。
B3.3.2.6 每次试验需做下列对照：
阳性参考血清对照；4孔补体对照(稀释液、补体、菌液各一滴，检查补体自然杀菌活性)；4孔细菌生长对照(稀释液、灭活补体和靶菌菌液各1滴)。每次检测时至少每5块微滴板中应有一组上述三种对照试验。
B3.3.2.7 往各孔滴完靶菌菌液之后，应将该菌液两滴分别滴加到一个巧克力色琼脂平皿的一端，沿着划好的两条线倾斜下流，于37℃烛缸内同时培养，次日检查每滴靶菌的菌落数及其纯度。
B3.3.2.8 判断结果时，先检查上述三种对照试验的结果：补体的和细菌生长对照的各孔应出现众多的红色点状小菌落；阳性参考血清应达到原来确定的杀菌滴度。若所试各孔中红色点状菌落数目明显地少于补体对照孔或不出现红色点状菌落时，则判断为杀菌阳性；如果所试孔中的菌落数目接近补体对照孔的一半或更多时，则判断为杀菌阴性。
B3.3.2.9 根据红色点状菌落数目的多少，以符号“＋”记录试验结果。若补体及靶菌生长对照各孔的细菌正常生长时，应出现众多红色点状菌落，可记为“＋＋＋＋”。当所试各孔与其比较，菌落数减少30％以下，记为“＋＋＋”；减少50％左右记为“＋＋”；减少70％左右记为“＋”；每孔少于10个菌落则记为“±”。以细菌生长成呈“＋”及以下者判断为杀菌阳性；以“＋＋”及以上者判为杀菌阴性。以出现杀菌阳性的血清最高稀释度为杀菌抗体的最高滴度。
附录C
(提示的附录)
胶乳凝集试验
C1 目的
应用胶乳凝集试验测定病人CSF、急性期血清和尿中Nm群特异抗原，辅助流脑临床诊断。
C2 材料
C2.1 10％胶乳颗粒(Latex Partic1es，Lx)悬液，颗粒直径为0.81μm。
C2.2 从兔免疫血清中提纯的抗A、B和C群Nm的IgG。
C2.3 在洁净玻璃板上，用红漆画两排红圈，其直径为3.5cm左右，漆干后备用。
C2.4 pH8.2，0.1mol/L硼酸盐缓冲液。
C2.5 BSA。
C2.6 白明胶。
C2.7 戊二醛。
C2.8 叠氮钠。
C2.9 怀疑流脑病人的CSF或急性期血清或尿液。
C3 试验方法
C3.1 兔抗不同群Nm的IgG致敏Lx。
C3.1.1 将10％Lx悬液用硼酸缓冲液再稀释80倍。
C3.1.2 取稀释的Lx悬液1个体积分别加等体积合适浓度的兔抗不同群Nm的IgG，置25mL容量的三角瓶中。
C3.1.3 在37℃水浴中旋转(120r/min)振荡瓶中的反应物，致敏Lx2h。必要时可在每毫升Lx中加25％戊二醛10～20μL，这将有助于Lx吸附IgG。
C3.1.4 离心致敏过的Lx(3000r/min，30min)，用1mL吸管小心吸取上清液，计量后弃之；再加含有0.1％BSA的硼酸盐缓冲液(Borate－Buffered Solution Containing BSA，BBSB)，混悬Lx，同上离心，弃上清，除去游离的IgG；照此重复洗涤Lx3次。
C3.1.5 用BBSB液再将Lx恢复到致敏时的浓度，加叠氮钠至终浓度为0.1％，置4℃备用3～6个月。
C3.1.6 用正常兔IgG同上步骤致敏Ix作为阴性对照。
C3.2 以胶乳凝集试验检测疑似流脑病人标本内Nm群特异性抗原。
C3.2.1 病人标本的处理：CSF离心(3000r/min，30min)，取上清，沉淀部分作细菌培养；急性期血液(2mL)，分离血清，置56℃将其灭活30min；急性期尿液5mL加20mL无水乙醇，置4℃1～2h，离心(3000r/min，15min)，弃上清，收集沉淀部分加0.25mL BBSB液将其溶解，同前离心，小心地吸取上清液待测，不要吸取尿中不溶解的沉渣。
C3.2.2 用BBSB液将处理过的标本从1：2起连续倍比稀释成不同的稀释度。
C3.2.3 用9号针头分别吸取各稀释度标本2滴滴到玻璃板上的红圈内，其中1滴滴到上列一排的红圈内，作为试验组；另1滴滴到下列一排的红圈内，作为平行对照组。
C3.2.4 往试验组的红圈内各加1滴免疫的兔IgG致敏过的Lx悬液；往对照组的红圈内各加1滴正常兔IgG所致敏的Lx悬液。
C3.2.5 轻轻地旋摇玻板，使标本与Lx充分混匀。
C3.2.6 在1～2min内即可见凝集，5min时凝集更明显，此时可记录试验结果。
C3.2.7 若只在试验组的红圈内出现明显凝集，但Lx本身与BBSB液以及在平行对照组的红圈内皆不出现凝集则判断为阳性反应。此时与阴性对照组比较，Lx悬液变得较清亮，Lx明显地聚集成较大的颗粒。
C3.2.8 在上述病人标本中只要有一种标本与抗任何一群Nm的IgG所致敏的Lx发生明显凝集反应，则说明所检标本中含有Nm相应群特异的抗原，即可辅助临床诊断为流脑。
附录D
(提示的附录)
以PCR检测病人急性期血清或CSF中Nm的DNA特异片段
D1 目的
应用PCR检查病人急性期血清或CSF中Nm的DNA特异片段，对流脑病人进行早期诊断。
D2 材料
D2.1 疑似流脑患者的CSF或急性期血清。
D2.2 Nm的模板DNA和正常人血清作为对照。
D2.3 4×dNTP。
D2.4 琼脂糖。
D2.5 溴化乙啶。
D2.6 Taq酶(Promega)。
D2.7 引物1为：5＇—ATTATTCAGACCGCCGGCAG—3′；
引物2为：5＇—CCGATAATCAGGCATCCG—3′。
D2.8 液体石蜡。
D2.9 无菌去离子水。
D2.10 紫外光检测器。
D2.11 PCR扩增仪。
D2.12 10×PCR反应缓冲液［500mmol/L KCl，100mmol/L Tris－HCl，(室温，pH8.3)，15mmol/LMgCl(下标始)2(下标终)，0.1％(W/V)］明胶。
D2.13 载样缓冲液(0.2％溴酚蓝，50％蔗糖)。
D2.14 1×TBE电泳缓冲液：
0.089m ol/L Tris－H(下标始)3(下标终)BO(下标始)3(下标终)
0.002mol/L EDTA
D2.15 电泳仪。
D2.16 分子量标准：λDNA－EcoR I/HindⅢ。
D3 扩增程序
在0.5mL Eppendorf管中分别加入：
反应物 加样顺序 体积(μL) 终浓度
10×缓冲液 1 5.0 1×缓冲液
4×dNTP混合物 2 4.0 200μmol/L 每种
dNTP
引物1 3 2.5 1μmol/L
引物2 4 2.5 1μmol/L
模板DNA或待检标本 5 5.0 5.0ng DNA/μL
(标本需95℃加热5min预处理)
无菌去离子水 6 30.5
(95℃水浴10min，快速离心30s)
TaqDNA聚合酶 7 0.5 1u
液体石蜡 8 25.0
D3.1 混匀离心，于72℃反应2min后即开始循环。循环参数如下：
94℃变性反应30s；
56℃退火反应30s；
72℃延伸反应60s。
D3.2 30个循环后再72℃延伸4min。
D3.3 反应结束，取出反应管冷至室温后置4℃供检测。
D4 扩增产物的检测
D4.1 取2μL反应产物与1μL载样缓冲液混合。
D4.2 用含溴化乙啶(0.5μg/mL)的1.2％琼脂糖凝胶检测扩增产物。
D4.3 75mm×48mm微型胶，以6V/cm电泳1h，电泳缓冲液为1×TBE。
D4.4 电泳结束后，将凝胶置紫外光检测器上观察结果、照相。
D4.5 扩增产物特异片段的长度为596个碱基对。
附录E
(提示的附录)
流行性脑脊髓膜炎治疗原则
E1 普通型
E1.1 一般治疗 卧床休息，流质饮食，必要时鼻饲或静脉补液。
E1.2 对症治疗 高热、头痛、呕吐、烦躁或惊厥等，应分别给予相应处理。
E1.3 病原治疗 轻症病例首选SD，疑对磺胺过敏或耐药者应改换其他药物如青霉素或氯霉素。
E1.3.1 磺胺嘧啶(SD)：成人6～8g/d，小儿0.15～0.2g/(kg·d)，每日总量不超过6g，加等量碳酸氢钠分3～4次服用，首剂加倍。频繁呕吐或不能口服者，应改为注射，SD为首选。成人4～6g/d，小儿0.1～0.15g/(kg·d)，分2～3次肌注或静脉滴注，其浓度应小于5％。
另可用SMZ－TMP(复方新诺明，每片含SMZ400mg、TMP80mg)，成人每8h服2片。小儿SMZ50mg/(kg·d)，TMP 10mg/(kg·d)，分2次口服。
E1.3.2 青霉素：单用青霉素，成人(800～2000)万u/d，小儿(20～40)万u/(kg·d)，分3～4次静脉滴注，疗程5～7天。
E1.3.3 氯霉素：对磺胺、青霉素过敏者或耐药者可选用。成人2～4g/d，小儿50～100mg/(kg·d)，分3～4次静脉滴注，疗程5～7天，新生儿禁用。使用过程中注意观察骨髓抑制情况。
E1.3.4 氨苄青霉素，适用于病情较重和病原不明者。成人4～6g/d，小儿150～300mg/(kg·d)，分2～3次静脉滴注，疗程5～7天。注意副作用。
E1.3.5 头孢氨噻肟(Cefotaxime)肌注(静脉滴注)，成人2～8g/d，儿童50～200mg/(kg·d)，分2～4次给药，或头孢噻肟三嗪(Ceftriaxone)每日用药一次，成人2～4g加到5％葡萄糖溶液50～100mL静脉滴注。儿童肌注15～200mg(平均46mg)/kg。此两种抗生素仅适用于不能应用青霉素和氯霉素的重症患者。
E2 休克型
E2.1 病因治疗：首选青霉素，剂量(20～40)万u/(kg·d)，多与氯霉素联合用药，病情好转后用法同普通型。
E2.2 抗休克治疗
E2.2.1 补充血容量(扩容)：可选用低分子右旋糖苷，成人500mL静脉内滴注，24h不超过1000mL，可根据中心静脉压、尿量调整补液速度。
E2.2.2 纠正酸中毒：成人先给5％碳酸氢钠200mL，后根据血生化检查结果而定。
E2.2.3 血管活性药：扩充血容量和纠正酸中毒后，若休克仍未纠正，可应用血管活性药山莨菪碱，剂量0.3～0.5mg/(kg·次)(儿童剂量酌增)，每10～20min静脉推注1次。待面色红润、微循环改善、尿量增加、血压回升后，即可延长给药时间。若应用山莨菪碱疗效不好，病情有加重趋势，可改用多巴胺。亦可一开始即首先选用多巴胺10～20mg加入100mL 5％～10％葡萄糖溶液中静脉滴入。开始以75～100μg/min的速度滴入，血压回升后逐渐调慢滴速。临床上以紫绀消失、面唇转红、脉搏有力、血压平稳、尿量增多等作为停药指征。
E2.2.4 抗凝治疗：如出现DIC应使用肝素治疗，剂量0.5～1mg/(kg·次)，加入10％葡萄糖溶液40～100mL内静脉滴注。必要时每4～6h重复一次，一般用药2～3次。每次用药前，需以试管法测定凝血时间，使凝血时间保持在15～30min。
重症休克时纤维蛋白溶酶增多，使血管内纤维蛋白溶解而加重出血，故治疗大片出血者，可先应用肝素，首次剂量为1mg/kg溶入20mL10％的葡萄糖溶液或生理盐水中静脉推注，继以1mg/kg溶入10％葡萄糖溶液或生理盐水50～100mL中，专用一个点滴瓶，在4h内缓慢滴完。用肝素2～4次立即见效，用药时间一般不超过24h。然后再用6－氨基己酸6g(儿童用量1～2g/次)加于10％葡萄糖液100mL中静滴，必要时4～6h重复一次。
E2.2.5 肾上腺皮质激素(激素)：其抗休克作用至今尚无定论。氢化考的松，成人用量300mg/d，小儿10～15mg/(kg·d)，分2～3次静脉滴注。或地塞米松，成人剂量为20～30mg/d，小儿为0.5mg/(kg·d)，分2～3次，静脉滴注。
E3 脑膜脑炎型
E3.1 抗菌药物的应用同前，治疗重点为减轻脑水肿，防止脑疝和呼吸衰竭。
E3.2 脱水剂应用：以20％甘露醇为主，剂量1～2g/(kg·次)。根据情况每4～6或8h静脉快速滴注(30min内注完)或推注。脱水剂用至颅内压增高症状好转，即可逐渐减量或延长给药时间，到完全停药需2～3天。如出现脑疝，可给速尿20～40mg加入20％甘露醇或25％山梨醇内静脉滴注。
E3.3 肾上腺皮质激素的应用同前。
E3.4 呼吸衰竭：用呼吸兴奋剂如山梗菜碱、可拉明、利他林或回苏灵等。吸氧、吸痰、保持气道通畅。如呼吸骤停，立即喉插管，或气管切开，行人工呼吸。
E4 混合型
应根据病情，参照休克型及脑膜脑炎型治疗。
附录F
(提示的附录)
流脑预防的原则
流脑是由Nm经空气飞沫传播而引起的一种急性传染病，病死率高，具有季节性发病高峰，在高发地区还具有周期性流行的特点。儿童发病率比成人发病率高，90％以上的病例是由A、B和C群Nm引起的。虽然目前在我国由B群Nm致病有所增多，但仍以A群Nm引起的病例最多见。Nm感染性强，人被感染后大多表现为鼻咽部带菌状态或出现上呼吸道轻度炎症，只有少数受感染者发展为流脑病人。A群Nm可以引起世界范围的流脑大流行，而B群和C群Nm主要引起局部地区流行或散发。人被Nm感染后可以获得一定的免疫力。尽管Nm感染性强，但它对外界的抵抗力较弱，在外环境中存活能力差。因此对流脑的预防应采取以注射菌苗为主的综合防治措施，重点预防的对象是易感人群。
F1 平时的预防措施
F1.1 开展群众性的卫生运动，预防此病传播。搞好居民居住地方、托儿机构、中小学校、厂矿、工地、商场和影剧院等场所的卫生状况，对减少流脑的播散具有重要意义。因此在此病流行前期要有计划地开展几次群众性卫生运动，清扫周围环境与室内卫生，注意通风、换气、勤晒衣被和儿童玩具。
F1.2 加强体育锻炼和营养，增强体质，提高机体抵御疾病的能力。
F1.3 宣传防治流脑的科普知识，增强广大群众预防流脑的意识，使病人能得到早发现、早报告、早诊断、早隔离治疗并使疫点得到早处理。
F1.4 坚持做好流脑流行病学监测。
F1.4.1 疫情监测：
F1.4.1.1 建立健全的流脑疫情报告网，经常检查疫情报告和漏报的情况，提高疫情报告的质量。
F1.4.1.2 与过去做比较，分析疫情升降水平和发病的趋势。
F1.4.1.3 比较病例年龄组百分构成比例的变化。
F1.4.1.4 分析病例地区分布的特点，散发、局部暴发或地区流行。流行时疫情扩散的路线与范围以及本地与毗连地区发病的关系。
F1.4.2 病原学和血清学监测：
F1.4.2.1 收集疑似流脑病人CSF或急性期血分离培养Nm或检测Nm群特异抗原，并保存菌株供鉴定菌群与菌型。若能收集到病人急性期尿标本，也可用于检测Nm群特异性抗原。
F1，4.2.2 在病人入院和出院时分别采取急性期和恢复期血测定血清抗体水平，可以对流脑病人进行追溯诊断。
F1.4.2.3 于流行前期在监测点内对2岁以下幼儿、学龄前与学龄儿童及成人抽样检查健康人群中Nm带菌情况，并保存部分带菌者菌株供进一步分型。
F1.4.2.4 群体免疫水平的监测：在检查Nm带菌的同时采取血液标本，分离血清，用ELISA法测定上述不同年龄组人群抗体水平。
F1.4.3 开展流脑监测时须注意其他呼吸道传染病的发病情况以及自然条件与社会环境的特殊变化。
F1.4.4 调查过去菌苗注射的情况及其预防效果。
F1.4.5 根据以上监测结果，分析流脑发病趋势，制定预防工作计划，落实菌苗预防及病人抢救治疗的措施。
F1.5 在流脑散发情况下A群脑膜炎双球菌多糖菌苗的常规免疫，于每年11月或12月对满6个月至2岁以下儿童进行基础免疫2针，其间隔时间为一个月。以后在第2和第3年再各加强免疫1针。儿童接种率须达到80％～90％，菌苗注射的剂量和部位等具体使用方法请遵照说明书的规定。
F2 流脑疫情的处理
流脑疫情的处理包括散发以及局部暴发或流行时疫情的处理。
F2.1 散发疫情的处理
F2.1.1 在采取上述措施的基础上认真做好流脑病人就地隔离治疗。如果当地确实不具备抢救条件须转诊时，也一定要在转诊前采取紧急措施并派医务人员护送。
F2.1.2 认真做好患者周围疑有流脑表现的病人的诊治，在患者周围人群(同家、同院、同班、同托儿所、同玩以及其他经常密切接触的成年人)中调查，若发现上感样的病人，应按轻度流脑患者处理，给磺胺药物或其他抗菌药物治疗2～3天，并注意观察病情，一旦病情转重，立即采样检验进行确诊并及时给予相应的治疗。
F2.1.3 若疫情发生在未实施A群脑膜炎双球菌多糖菌苗免疫的地方或发生在只对幼儿进行了免疫的地区，须对病人周围人群中15岁以下未免疫的儿童应急接种上述菌苗(有菌苗接种禁忌症者除外)。
F2.1.4 在处理疫情时，需及时采取病人标本，分离培养Nm或检测抗原或测定急性期与恢复期血清抗体，进行血清学诊断。若发现不是A群Nm而是B群或其他群Nm引起发病时，注射上述菌苗无预防作用，应对病人周围密切接触的人群进行药物预防。
F2.1.5 抗菌药物预防首选SD等磺胺药物，若预防效果不佳可酌情使用利福平。
F2.1.5.1 SD：成人每天4～6g，儿童用量为0.1g/(kg·d)，分两次口服，首剂加倍。连服3～5天，均同时服用等量苏打。
F2.1.5.2 磺胺异噁唑(SIZ)：成人4～6g/d，儿童用量为0.1～0.2g/(kg·d)，分4次口服，首剂加倍，连服3～5天。
F2.1.5.3 利福平：成人每12h 600mg，儿童每12h 10mg/kg，服用2天。
F2.2 局部暴发或地区流行时疫情的处理
F2.2.1 对流脑病人和在病人周围人群中所发现的上感样病人的处理同F2.1.1和F2.1.2。
F2.2.2 若暴发或流行发生在未实施菌苗免疫的地区或发生在只对幼儿进行了免疫的地区，除了对暴发或流行范围内90％以上15岁以下儿童应给予应急接种菌苗外，还必须对病人同家、同院、同厂矿与工地、同兵营以及经常密切接触病人的其他成年人酌情应急注射菌苗。
F2.2.3 同F2.1.4一样进行检查，以确定引起暴发或流行的Nm血清群。一旦发现它不是A群而是B群或其他群Nm时必须同上述一样对病人周围密切接触的人群进行抗菌药物预防。
F2.2.4 一旦发现流脑流行，须劝阻群众探视病人或到流行地区探亲访友，暂停在流行地区内举行群众性聚会。
